การเปรียบเทียบเทคนิคการใช้กล้องจุลทรรศน์ความละเอียดสูงแบบต่างๆ
สำหรับกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงแบบธรรมดา การเลี้ยวเบนของแสงจะจำกัดความละเอียดของภาพไว้ที่ประมาณ 250 นาโนเมตร ทุกวันนี้ เทคนิคความละเอียดสูงสามารถปรับปรุงสิ่งนี้ได้มากกว่า 10 เท่า เทคนิคนี้ทำได้โดยส่วนใหญ่ผ่านสามวิธี: กล้องจุลทรรศน์แบบโลคัลไลเซชันโมเลกุลเดี่ยว รวมถึงกล้องจุลทรรศน์แบบโลคัลไลเซชันแบบไวแสง (PALM) และกล้องจุลทรรศน์แบบสร้างใหม่ด้วยแสงแบบสโทแคสติก (STORM); กล้องจุลทรรศน์ส่องสว่างแบบมีโครงสร้าง (SIM); และการกระตุ้นด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบลดการปล่อยก๊าซเรือนกระจก (STED) วิธีการเลือกเทคโนโลยีความละเอียดสูงคือสิ่งที่ทุกคนให้ความสำคัญ "น่าเสียดายที่ไม่มีหลักการง่ายๆ ในการตัดสินใจว่าจะใช้วิธีใด" แมธิว สเตรซี นักวิจัยหลังปริญญาเอกจากมหาวิทยาลัยออกซ์ฟอร์ด สหราชอาณาจักรกล่าว "แต่ละคนมีข้อดีและข้อเสียของตัวเอง" แน่นอนว่านักวิทยาศาสตร์กำลังค้นหาวิธีการเลือกวิธีการที่เหมาะสมสำหรับโครงการเฉพาะ "ในบริบทของการถ่ายภาพทางชีวภาพ ปัจจัยสำคัญที่ต้องพิจารณา ได้แก่ ความละเอียดเชิงพื้นที่และเชิงเวลา ความไวต่อความเสียหายจากแสง ความสามารถในการติดฉลาก ความหนาของตัวอย่าง และการเรืองแสงพื้นหลังหรือการเรืองแสงของเซลล์เอง" วิธีการทำงาน ไมโครสโคปที่มีความละเอียดสูงหลายรุ่นทำงานในรูปแบบต่างๆ ในกรณีของ PALM และ STORM เครื่องหมายฟลูออเรสเซนต์เพียงส่วนน้อยเท่านั้นที่ตื่นเต้นหรือเปิดใช้งานภาพถ่ายในช่วงเวลาที่กำหนด ทำให้สามารถระบุตำแหน่งได้อย่างอิสระด้วยความแม่นยำสูง การผ่านขั้นตอนนี้ด้วยฉลากเรืองแสงทั้งหมดทำให้ได้ภาพที่มีความละเอียดสูงสุดสมบูรณ์ Stefan Hell หนึ่งในผู้ชนะรางวัลโนเบลสาขาเคมีประจำปี 2014 และผู้อำนวยการสถาบัน Max Planck Institute of Biophysical Chemistry กล่าวว่า "ระบบ PALM/STORM นั้นติดตั้งค่อนข้างง่าย แต่ใช้งานยาก เนื่องจากระบบเรืองแสง กลุ่มต้องมีความสามารถในการกระตุ้นด้วยแสง ข้อ จำกัด ข้อเสียคือต้องตรวจจับโมเลกุลเรืองแสงเดี่ยวในบริบทของเซลล์และมีความน่าเชื่อถือน้อยกว่า STED" STED ใช้เลเซอร์พัลส์เพื่อกระตุ้นฟลูออโรฟอร์และเลเซอร์รูปวงแหวนเพื่อดับฟลูออโรฟอร์ เหลือเพียงฟลูออเรสเซนต์ขนาดนาโนเมตรระดับกลางสำหรับความละเอียดสูงสุด การสแกนตัวอย่างทั้งหมดจะสร้างภาพ "ข้อได้เปรียบของ STED คือมันเป็นเทคโนโลยีปุ่มกด" เฮลล์อธิบาย "มันทำงานเหมือนกับกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์คอนโฟคอลมาตรฐาน" นอกจากนี้ยังสามารถถ่ายภาพเซลล์ที่มีชีวิตโดยใช้ฟลูออโรฟอร์ เช่น โปรตีนเรืองแสงสีเขียวหรือสีเหลือง และสีย้อมที่ได้มาจากโรดามีน การเปรียบเทียบพาราเมตริก แม้ว่าเทคนิคความละเอียดสูงทั้งหมดจะเหนือกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงทั่วไปในแง่ของความละเอียด แต่ก็แตกต่างกัน SIM เพิ่มความละเอียดเป็นสองเท่าประมาณ 100 นาโนเมตร PALM และ STORM สามารถแก้ไขเป้าหมาย 15 นาโนเมตร จากข้อมูลของ Hell STED ให้ความละเอียดเชิงพื้นที่ 30 นาโนเมตรในเซลล์ที่มีชีวิตและ 15 นาโนเมตรในเซลล์คงที่ เมื่อพูดถึงการใช้งานเฉพาะ เราต้องพิจารณาอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนด้วย ในบางกรณี ความละเอียดที่ต่ำกว่าแต่ SNR สูงกว่าอาจส่งผลให้ภาพดีกว่าในทางตรงกันข้าม (ความละเอียดสูงกว่าแต่ SNR ต่ำกว่า) ความเร็วในการรับภาพมีความสำคัญมากเช่นกัน โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับเซลล์ที่มีชีวิต "เทคนิคความละเอียดสูงทั้งหมดนั้นช้ากว่าเทคนิคการถ่ายภาพด้วยแสงฟลูออเรสเซนต์ทั่วไป" สเตรซีกล่าว "PALM/STORM ช้าที่สุด ต้องการเฟรมหลายหมื่นเฟรมเพื่อให้ได้ภาพเดียว SIM ต้องการเฟรมหลายสิบเฟรม และ STED เป็นเทคโนโลยีการสแกน ดังนั้นความเร็วในการรับจึงขึ้นอยู่กับขนาดของขอบเขตการมองเห็น" นอกจากเซลล์ที่มีชีวิตหรือเซลล์สร้างภาพคงที่แล้ว นักวิทยาศาสตร์บางคนยังต้องการเข้าใจว่าวัตถุเคลื่อนที่อย่างไร สเตรซีสนใจที่จะทำความเข้าใจพลวัตของระบบชีวภาพในเซลล์ของสิ่งมีชีวิต ไม่ใช่แค่ภาพนิ่ง เขารวม PALM เข้ากับการติดตามอนุภาคเดี่ยวเพื่อวิเคราะห์ไดนามิกในเซลล์ของสิ่งมีชีวิต ด้วยวิธีนี้ เขาสามารถติดตามโมเลกุลของเครื่องหมายได้โดยตรงขณะที่พวกมันทำหน้าที่ของมัน อย่างไรก็ตาม เขาเชื่อว่า SIM ไม่เหมาะสำหรับการศึกษากระบวนการไดนามิกเหล่านี้ในระดับโมเลกุล แต่เนื่องจากความเร็วในการรับข้อมูลที่รวดเร็ว จึงเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการสังเกตไดนามิกของโครงสร้างขนาดใหญ่ เช่น โครโมโซมทั้งหมด ผลลัพธ์ล่าสุด ในปี 2560 ทีมงานของ Hell ได้รายงานกล้องจุลทรรศน์ความละเอียดสูงพิเศษ MINFLUX ใน Science จากข้อมูลของ Hell วิธีการที่มีความละเอียดสูงนี้ทำให้ได้ความละเอียดเชิงพื้นที่ 1 นาโนเมตรเป็นครั้งแรก นอกจากนี้ยังสามารถติดตามแต่ละโมเลกุลในเซลล์ของสิ่งมีชีวิตได้เร็วกว่าวิธีอื่นๆ อย่างน้อย 100 เท่า นักวิทยาศาสตร์คนอื่นๆ ก็พูดถึงกล้องจุลทรรศน์ MINFLUX อย่างมากเช่นกัน Shechtman กล่าวว่า "แอปพลิเคชันและวิธีการใหม่ๆ ได้รับการพัฒนาอย่างต่อเนื่อง แต่ความก้าวหน้าสองอย่างที่โดดเด่นสำหรับฉัน" Shechtman กล่าว หนึ่งคือ MINFLUX "มันใช้วิธีการอันชาญฉลาดเพื่อให้ได้ตำแหน่งโมเลกุลที่แม่นยำมาก" เกี่ยวกับการพัฒนาที่น่าตื่นเต้นครั้งที่สอง Shechtman กล่าวถึง WE Moerner และเพื่อนร่วมงานของเขาที่มหาวิทยาลัยสแตนฟอร์ด มอร์เนอร์ยังเป็นผู้รับรางวัลโนเบลสาขาเคมีประจำปี 2557 หนึ่งในผู้ชนะ เพื่อจัดการกับข้อจำกัดของความละเอียดในการถ่ายภาพที่เกิดจากการกระเจิงแบบแอนไอโซโทรปิกของโมเลกุลเดี่ยวเรืองแสง นักวิทยาศาสตร์ใช้โพลาไรเซชันกระตุ้นที่แตกต่างกันเพื่อกำหนดทิศทางและตำแหน่งของโมเลกุล นอกจากนี้ พวกเขายังได้พัฒนาพื้นผิวรูม่านตาที่บอบบาง เทคนิคเหล่านี้ปรับปรุงความสามารถในการแปลโครงสร้าง เกี่ยวกับฉลากเรืองแสง ในการใช้งานที่มีความละเอียดสูงมาก ฉลากมีความสำคัญจริงๆ นอกจากนี้ยังมีบาง บริษัท ที่ให้บริการผลิตภัณฑ์ที่เกี่ยวข้อง ตัวอย่างเช่น บริษัท Miltenyi ของเยอรมนีได้ร่วมมือกับบริษัท Abberior ซึ่งเป็นบริษัทที่ก่อตั้งโดย Stefan Hell เพื่อให้บริการการผันแอนติบอดีแบบกำหนดเองสำหรับสีย้อมด้วยกล้องจุลทรรศน์ความละเอียดสูงพิเศษ บริษัท อื่น ๆ หลายแห่งเสนอเครื่องหมายที่ตรงกัน "Nano-Boosters ของเรามีขนาดเล็กมาก เพียง 1.5 kDa และมีความเฉพาะเจาะจงสูง" Christoph Eckert เจ้าหน้าที่ฝ่ายการตลาดของ ChromoTek กล่าว โปรตีนเหล่านี้จับกับโปรตีนเรืองแสงสีเขียวและสีแดง (GFP และ RFP) พวกมันได้มาจากชิ้นส่วนแอนติบอดีของอัลปาก้าหรือที่เรียกว่า VHH หรือนาโนบอดี ซึ่งมีคุณสมบัติในการจับที่ดีเยี่ยมและมีคุณภาพที่คงที่โดยไม่มีการเปลี่ยนแปลงแบบแบทช์ต่อแบทช์ เครื่องหมายเหล่านี้เหมาะสำหรับเทคนิคความละเอียดสูงต่างๆ เช่น SIM, PALM, STORM และ STED Ai-Hui Tang ผู้ช่วยศาสตราจารย์แห่ง University of Maryland School of Medicine และเพื่อนร่วมงานใช้ GFP-Booster และ STORM ของ ChromoTek เพื่อสำรวจการแพร่กระจายข้อมูลในระบบประสาท พวกเขาพบกลุ่มนาโนโมเลกุลที่เรียกว่า nanocolumns ในเซลล์ประสาท presynaptic และ postynaptic นักวิทยาศาสตร์เชื่อว่าโครงสร้างนี้แสดงให้เห็นว่าระบบประสาทส่วนกลางใช้หลักการง่ายๆ เพื่อรักษาและควบคุมประสิทธิภาพของซินแนปติก การถ่ายภาพที่มีความละเอียดสูงรุ่นต่างๆ และวิธีการจำนวนมากขึ้นเรื่อยๆ กำลังพานักวิทยาศาสตร์เจาะลึกเข้าไปในความลึกลับทางชีววิทยา ด้วยการทำลายขีดจำกัดการเลี้ยวเบนของแสงที่ตามองเห็น นักชีววิทยาจึงสามารถ "ติดตามอย่างใกล้ชิด" การทำงานของเซลล์ได้
