การหาจำนวนจุลินทรีย์ - วิธีการนับโดยตรงของกล้องจุลทรรศน์!

การหาจำนวนจุลินทรีย์ - วิธีการนับโดยตรงของกล้องจุลทรรศน์!

การเติบโตของประชากรแบคทีเรียนั้นเกิดจากการเพิ่มจำนวนเซลล์หรือมวลเซลล์เพิ่มขึ้น วิธีการกำหนดจำนวนเซลล์รวมถึงวิธีการนับด้วยกล้องจุลทรรศน์โดยตรง วิธีการนับจำนวนจาน วิธีอัตราส่วนน้ำมันโฟโตอิเล็กทริก วิธีความน่าจะเป็นสูงสุด และวิธีการกรองเมมเบรน วิธีการตรวจวัดสสารของเซลล์ประกอบด้วยการหาน้ำหนักแห้งของเซลล์ การหาส่วนประกอบของเซลล์บางอย่าง เช่น ไนโตรเจน ปริมาณ RNA และ DNA และการหาปริมาณเมแทบอไลต์ กล่าวโดยสรุปคือ มีหลายวิธีในการวัดการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ แต่ละวิธีมีข้อดีและข้อเสียต่างกันไป และควรเลือกให้เหมาะกับสถานการณ์เฉพาะ การทดลองนี้แนะนำวิธีการนับจำนวนโดยตรงด้วยกล้องจุลทรรศน์ที่ใช้กันทั่วไปในการผลิตและการวิจัยทางวิทยาศาสตร์เป็นหลัก

1. ข้อกำหนดวัตถุประสงค์

1. ชี้แจงหลักการนับเม็ดเลือด

2. เชี่ยวชาญวิธีการนับจำนวนจุลินทรีย์โดยใช้เครื่องนับเซลล์เม็ดเลือด

2. หลักการพื้นฐาน

วิธีการนับโดยตรงด้วยกล้องจุลทรรศน์เป็นวิธีที่ง่าย รวดเร็ว และหยั่งรู้ในการนับจำนวนสารแขวนลอยของตัวอย่างที่จะทดสอบโดยตรงบนสไลด์แก้วพิเศษที่มีพื้นที่และปริมาตรที่แน่นอน (หรือที่เรียกว่าเครื่องนับจำนวนแบคทีเรีย) วิธีการ ในปัจจุบัน เครื่องนับจำนวนแบคทีเรียที่ใช้กันทั่วไปในประเทศและต่างประเทศได้แก่: แผงนับเซลล์เม็ดเลือด, เครื่องนับแบคทีเรีย Peteroff-Hauser และเครื่องนับแบคทีเรีย Hawksley เป็นต้น สามารถใช้สำหรับการนับยีสต์ แบคทีเรีย สปอร์ของเชื้อรา และสารแขวนลอยอื่นๆ และ หลักการพื้นฐานเหมือนกัน เครื่องนับจำนวนแบคทีเรีย 2 ประเภทหลังมีปริมาตรรวม 0.02 มม.3 หลังจากปิดด้วยกระจกครอบ และระยะห่างระหว่างกระจกครอบกับสไลด์เพียง 0.02 มม. ดังนั้นน้ำมัน เลนส์ใกล้วัตถุแบบแช่สามารถใช้เพื่อสังเกตและสังเกตเซลล์ขนาดเล็ก เช่น แบคทีเรีย นับ. นอกจากเครื่องวัดแบคทีเรียเหล่านี้แล้ว ยังมีวิธีการประมาณอัตราส่วนของพื้นที่สเมียร์ต่อพื้นที่ลานสายตาที่สังเกตได้โดยตรงภายใต้กล้องจุลทรรศน์ ซึ่งโดยทั่วไปจะใช้สำหรับการตรวจทางแบคทีเรียของนม ข้อดีของวิธีการนับจำนวนโดยตรงด้วยกล้องจุลทรรศน์คือใช้งานง่าย รวดเร็ว และใช้งานง่าย อย่างไรก็ตาม ข้อเสียของวิธีนี้คือผลลัพธ์ที่วัดได้มักจะเป็นผลรวมของเซลล์ที่ตายแล้วและเซลล์ที่มีชีวิต ในปัจจุบัน มีวิธีการบางอย่างที่จะแก้ไขข้อบกพร่องนี้ เช่น การผสมแบคทีเรียที่มีชีวิตด้วยการย้อมไมโครแชมเบอร์ (ระยะเวลาสั้นๆ) และการเติมตัวยับยั้งการแบ่งเซลล์เพื่อให้บรรลุวัตถุประสงค์ในการนับเฉพาะแบคทีเรียที่มีชีวิต

ในการทดลองนี้ ใช้เครื่องวัดปริมาณเม็ดเลือดเป็นตัวอย่างในการนับด้วยกล้องจุลทรรศน์โดยตรง สำหรับการใช้เครื่องนับจำนวนแบคทีเรียอีก 2 ประเภท โปรดดูคำแนะนำจากผู้ผลิตแต่ละราย การนับโดยตรงภายใต้กล้องจุลทรรศน์ด้วยเครื่องวัดปริมาณเม็ดเลือดเป็นวิธีที่ใช้กันทั่วไปในการนับจำนวนจุลินทรีย์ แผ่นนับคือสไลด์แก้วพิเศษซึ่งมีสามแพลตฟอร์มประกอบด้วยสี่ช่อง แพลตฟอร์มที่กว้างขึ้นตรงกลางแบ่งออกเป็นสองส่วนโดยช่องตามขวางสั้น ๆ และมีตารางที่แต่ละด้านของแพลตฟอร์ม แต่ละตารางแบ่งออกเป็นเก้าช่องสี่เหลี่ยมขนาดใหญ่ และช่องสี่เหลี่ยมขนาดใหญ่ตรงกลางคือห้องนับ โครงสร้างของจานนับเซลล์เม็ดเลือดแสดงในรูปที่ ล{{{{10}}}} มาตราส่วนของห้องนับโดยทั่วไปมีข้อกำหนดสองประการ หนึ่งคือ สี่เหลี่ยมขนาดใหญ่ที่แบ่งออกเป็นสี่เหลี่ยมตรงกลาง 25 อัน และสี่เหลี่ยมตรงกลางแต่ละอันจะแบ่งออกเป็นสี่เหลี่ยมเล็กๆ 16 อัน (รูปที่ 15-2) อีกอันหนึ่งเป็นสี่เหลี่ยมขนาดใหญ่ จัตุรัสแบ่งออกเป็นช่องกลาง 16 ช่อง และช่องตรงกลางแต่ละช่องแบ่งเป็นช่องสี่เหลี่ยมเล็กๆ 25 ช่อง แต่ไม่ว่าจะเป็นกระดานนับแบบใด จะมีช่องสี่เหลี่ยมเล็กๆ 400 ช่องในแต่ละช่องใหญ่ ความยาวด้านของสี่เหลี่ยมขนาดใหญ่แต่ละอันคือ 1 มม. และพื้นที่ของสี่เหลี่ยมจัตุรัสขนาดใหญ่แต่ละอันคือ 1 มม. 2 หลังจากปิดด้วยกระจกครอบแล้ว ความสูงระหว่างกระจกครอบและกระจกสไลด์คือ 0.1 มม. ดังนั้นปริมาตรของช่องนับคือ 0.lmm3 (หนึ่งในพันของมิลลิลิตร) รูป 15-1 โครงสร้างกระดานนับเม็ดเลือด (1) รูป 15-2 โครงสร้างกระดานนับเม็ดเลือด (2) A. มุมมองด้านหน้า; B. มุมมองส่วนตามยาว ตารางขยายใหญ่ตรงกลางคือห้องตรวจนับ 1. แผงนับเซลล์เม็ดเลือด; 2. ครอบแก้ว; 3. เวลานับในห้องนับ ปกติจะนับจำนวนแบคทีเรียทั้งหมดในช่องสี่เหลี่ยม 5 ช่อง แล้วคำนวณค่าเฉลี่ยของแต่ละช่อง แล้วคูณด้วย 25 หรือ 16 จะได้จำนวนแบคทีเรียทั้งหมดในช่องสี่เหลี่ยมขนาดใหญ่ แล้วแปลงเป็น จำนวนแบคทีเรียทั้งหมดในสารละลายแบคทีเรีย 1 มล. ให้จำนวนแบคทีเรียทั้งหมดในช่องสี่เหลี่ยมทั้งห้าเป็น A และอัตราส่วนการเจือจางของสารละลายแบคทีเรียเป็น B หากเป็นจานนับที่มี 25 ช่อง จำนวนแบคทีเรียทั้งหมดในสารละลายแบคทีเรีย 1 มล. {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(ชิ้น) ในทำนองเดียวกัน หากเป็นจานนับที่มีสี่เหลี่ยมขนาดกลาง 16 ช่อง จำนวนแบคทีเรียทั้งหมดในสารละลายแบคทีเรีย 1 มล.=A/ 5×16×104×B=32000A·B (ชิ้น)

3. อุปกรณ์

1. แบคทีเรีย

Saccharomyces cerevisiae

2. เครื่องมือหรือเครื่องใช้อื่นๆ

เครื่องวัดเม็ดเลือด, กล้องจุลทรรศน์, แผ่นปิด, หลอดหยดฝอยที่ผ่านการฆ่าเชื้อ

4. ขั้นตอนการดำเนินงาน

1. การเตรียมสารแขวนลอยแบคทีเรีย

Saccharomyces cerevisiae ถูกเตรียมเป็นยาแขวนตะกอนแบคทีเรียที่มีความเข้มข้นที่เหมาะสมด้วยน้ำเกลือทางสรีรวิทยาที่ปราศจากเชื้อ

2. ห้องนับกล้องจุลทรรศน์

ก่อนเติมตัวอย่าง ให้ตรวจสอบห้องนับของจานนับด้วยกล้องจุลทรรศน์ หากมีสิ่งสกปรกต้องทำความสะอาดและทำให้แห้งก่อนนับ

3. เพิ่มตัวอย่าง

ปิดฝาครอบเครื่องวัดปริมาณเลือดในเลือดที่สะอาดและแห้งด้วยใบปิด จากนั้นใช้หลอดหยดฝอยที่ปราศจากเชื้อเพื่อหยดสารแขวนลอย Saccharomyces cerevisiae ที่เขย่าแล้วหยดเล็ก ๆ จากขอบใบปิด แล้วปล่อยให้สารละลายแบคทีเรียเคลื่อนที่ไปตามช่องว่างโดยอัตโนมัติโดยการออสโมซิสของเส้นเลือดฝอย เมื่อเข้าไปในห้องนับ ห้องนับทั่วไปสามารถเติมของเหลวจากแบคทีเรียได้ เมื่อสุ่มตัวอย่าง ให้เขย่าสารละลายแบคทีเรียก่อน เมื่อเพิ่มตัวอย่าง ไม่ควรมีฟองอากาศเกิดขึ้นในห้องตรวจนับ

4. การนับด้วยกล้องจุลทรรศน์

หลังจากเพิ่มตัวอย่างแล้ว ให้ยืนนิ่งเป็นเวลา 5 นาที จากนั้นวางเครื่องวัดปริมาณเม็ดเลือดบนระยะกล้องจุลทรรศน์ ขั้นแรกให้หาตำแหน่งของห้องตรวจนับด้วยกล้องจุลทรรศน์กำลังต่ำ แล้วจึงเปลี่ยนไปใช้กล้องจุลทรรศน์กำลังสูงเพื่อตรวจนับ ปรับความเข้มของแสงไมโครสโคปให้เหมาะสม สำหรับกล้องจุลทรรศน์ที่ใช้กระจกในการให้แสง ระวังอย่าให้แสงเบี่ยงเบนไปด้านใดด้านหนึ่ง มิฉะนั้นจะมองเห็นเส้นตารางของห้องนับได้ไม่ชัดเจนในด้านการมองเห็น ไม่เช่นนั้นเส้นแนวตั้งหรือแนวนอนเท่านั้นที่จะมองเห็นได้ จะได้เห็น หากพบว่าสารละลายแบคทีเรียมีความเข้มข้นหรือเจือจางเกินไปก่อนนับ จำเป็นต้องปรับการเจือจางใหม่ก่อนนับ โดยทั่วไป การเจือจางตัวอย่างต้องใช้แบคทีเรียประมาณ 5 ถึง 10 ตัวในแต่ละเซลล์ขนาดเล็ก แต่ละช่องนับจะเลือกเซลล์ตรงกลาง 5 เซลล์ (เลือกได้ 4 มุมและหนึ่งเซลล์ตรงกลางตรงกลาง) สำหรับการนับ โดยทั่วไปเซลล์ที่อยู่บนเส้นกริดจะนับเฉพาะในเส้นบนและขวาเท่านั้น ในกรณีของการแตกหน่อของยีสต์ เมื่อขนาดของหน่อถึงครึ่งหนึ่งของเซลล์แม่ จะนับเป็นเซลล์แบคทีเรียสองเซลล์ ในการนับตัวอย่าง ให้คำนวณปริมาณแบคทีเรียของตัวอย่างโดยคำนวณค่าเฉลี่ยจากช่องนับสองช่อง

5. ล้างค่าเม็ดเลือด

หลังการใช้งาน ให้ล้างกระดานนับเซลล์เม็ดเลือดด้วยน้ำในก๊อก ห้ามใช้วัตถุแข็งขัดถู และเช็ดให้แห้งด้วยตัวเองหรือใช้ไดร์เป่าผมหลังจากล้าง การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์เพื่อสังเกตว่ามีแบคทีเรียหรือตะกอนอื่น ๆ หลงเหลืออยู่ในเซลล์ขนาดเล็กแต่ละเซลล์หรือไม่ หากไม่สะอาดต้องล้างซ้ำจนกว่าจะสะอาด