ความแตกต่างระหว่างกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงและกล้องจุลทรรศน์ธรรมดา
1. ดูวิธีการจัดแสง
วิธีการส่องสว่างของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์โดยทั่วไปเป็นแบบอีพี กล่าวคือ แหล่งกำเนิดแสงจะวางบนตัวอย่างทดสอบผ่านเลนส์ใกล้วัตถุ
2. ดูที่ความละเอียด
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ใช้แสงอัลตราไวโอเลตเป็นแหล่งกำเนิดแสง โดยมีความยาวคลื่นค่อนข้างสั้น แต่มีความละเอียดสูงกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงทั่วไป
3 ความแตกต่างในตัวกรอง
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ใช้ฟิลเตอร์พิเศษ 2 ชิ้น ใช้ที่ด้านหน้าของแหล่งกำเนิดแสงเพื่อกรองแสงที่มองเห็นออก และใช้ระหว่างเลนส์ใกล้วัตถุกับเลนส์ใกล้ตาเพื่อกรองแสงอัลตราไวโอเลต ซึ่งสามารถปกป้องดวงตาของมนุษย์ได้
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์เป็นกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงชนิดหนึ่ง ส่วนใหญ่เป็นเพราะความยาวคลื่นที่กระตุ้นด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงนั้นสั้น ดังนั้นสิ่งนี้จึงนำไปสู่ความแตกต่างในโครงสร้างและการใช้งานของกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงและกล้องจุลทรรศน์ธรรมดา กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ส่วนใหญ่ทำหน้าที่จับแสงอ่อนได้ดี ดังนั้นภายใต้แสงฟลูออเรสเซนต์ที่อ่อนมาก ความสามารถในการถ่ายภาพของมันจึงดีเช่นกัน เมื่อรวมกับการปรับปรุงอย่างต่อเนื่องของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา สัญญาณรบกวนก็ลดลงอย่างมากเช่นกัน จึงมีการใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงมากขึ้นเรื่อยๆ
ความรู้เกี่ยวกับกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบสองโฟตอน
หลักการพื้นฐานของการกระตุ้นสองโฟตอนคือ: ในกรณีของโฟตอนที่มีความหนาแน่นสูง โมเลกุลของฟลูออเรสเซนต์สามารถดูดซับโฟตอนความยาวคลื่นยาวสองตัวได้ในเวลาเดียวกัน และหลังจากช่วงชีวิตที่มีสถานะกระตุ้นสั้นมาก จะปล่อยโฟตอนความยาวคลื่นสั้นออกมา ; ผลจะเหมือนกับการใช้โฟตอนที่มีความยาวคลื่นครึ่งหนึ่งของความยาวคลื่นยาวเพื่อกระตุ้นโมเลกุลเรืองแสง การกระตุ้นโฟตอนแบบสองต้องการความหนาแน่นของโฟตอนสูง และเพื่อไม่ให้เซลล์เสียหาย กล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอนจึงใช้เลเซอร์พัลซิ่งที่ล็อคโหมดพลังงานสูง เลเซอร์นี้ปล่อยแสงเลเซอร์ที่มีพลังงานสูงสุดสูงและพลังงานเฉลี่ยต่ำ โดยมีความกว้างพัลส์เพียง 100 เฟมโตวินาทีและความถี่ 80 ถึง 100 เมกะเฮิรตซ์ เมื่อใช้เลนส์ใกล้วัตถุที่มีรูรับแสงเป็นตัวเลขสูงเพื่อโฟกัสโฟตอนของเลเซอร์พัลซิ่ง ความหนาแน่นของโฟตอนที่จุดโฟกัสของเลนส์ใกล้วัตถุจะสูงที่สุด และการกระตุ้นโฟตอนแบบสองโฟตอนจะเกิดขึ้นที่จุดโฟกัสของเลนส์ใกล้วัตถุเท่านั้น ดังนั้นกล้องจุลทรรศน์สองโฟตอนจึงไม่จำเป็นต้องมีรูเข็มแบบคอนโฟคอล ซึ่งช่วยปรับปรุงประสิทธิภาพการตรวจจับฟลูออเรสเซนต์
ในปรากฏการณ์เรืองแสงทั่วไป เนื่องจากความหนาแน่นของโฟตอนต่ำของแสงกระตุ้น โมเลกุลของฟลูออเรสเซนต์สามารถดูดซับโฟตอนได้เพียงหนึ่งตัวในเวลาเดียวกัน จากนั้นจึงปล่อยโฟตอนที่เรืองแสงผ่านการเปลี่ยนผ่านของรังสี ซึ่งเรียกว่าการเรืองแสงโฟตอนเดียว สำหรับกระบวนการกระตุ้นการเรืองแสงด้วยเลเซอร์เป็นแหล่งกำเนิดแสง อาจเกิดปรากฏการณ์การเรืองแสงแบบสองโฟตอนหรือหลายโฟตอนได้ ในขณะนี้ ความเข้มของแหล่งกำเนิดแสงกระตุ้นที่ใช้อยู่ในระดับสูง และความหนาแน่นของโฟตอนเป็นไปตามข้อกำหนดที่โมเลกุลเรืองแสงจะดูดซับโฟตอนสองตัวในเวลาเดียวกัน ในกระบวนการใช้เลเซอร์ทั่วไปเป็นแหล่งกำเนิดแสงกระตุ้น ความหนาแน่นของโฟตอนยังคงไม่เพียงพอที่จะทำให้เกิดการดูดกลืนแสงแบบสองโฟตอน โดยปกติแล้วจะใช้เลเซอร์พัลซิ่งเฟมโตวินาที และพลังงานทันทีของมันสามารถเข้าถึงคำสั่งของเมกะวัตต์ ดังนั้น ความยาวคลื่นของการเรืองแสงแบบสองโฟตอนจึงสั้นกว่าความยาวคลื่นของแสงกระตุ้น ซึ่งเทียบเท่ากับผลที่เกิดจากการกระตุ้นด้วยความยาวคลื่นครึ่งคลื่น
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบสองโฟตอนมีข้อดีหลายประการ:
1) แสงที่มีความยาวคลื่นยาวได้รับผลกระทบจากการกระเจิงน้อยกว่าแสงที่มีความยาวคลื่นสั้นและสามารถทะลุผ่านชิ้นงานได้ง่าย
2) โมเลกุลเรืองแสงที่อยู่นอกระนาบโฟกัสจะไม่ถูกกระตุ้น เพื่อให้แสงกระตุ้นสามารถเข้าถึงระนาบโฟกัสได้มากขึ้น เพื่อให้แสงกระตุ้นสามารถทะลุผ่านตัวอย่างที่ลึกขึ้นได้
3) แสงอินฟราเรดใกล้ความยาวคลื่นยาวมีความเป็นพิษต่อเซลล์น้อยกว่าแสงความยาวคลื่นสั้น
4) เมื่อดูตัวอย่างด้วยกล้องจุลทรรศน์โฟตอนแบบสองโฟตอน การฟอกสีด้วยแสงและความเป็นพิษต่อแสงจะปรากฏที่ระนาบโฟกัสเท่านั้น ดังนั้น กล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอนจึงเหมาะสำหรับการดูชิ้นงานที่มีความหนามากกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบโฟตอนเดียว สำหรับการดูเซลล์ที่มีชีวิต หรือสำหรับการทดลองการฟอกสีด้วยแสงแบบจุดตายตัว
ความรู้เกี่ยวกับกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบคอนโฟคอล
หลักการพื้นฐานของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบคอนโฟคอล: การใช้แหล่งกำเนิดแสงแบบจุดเพื่อให้แสงสว่างแก่ชิ้นงาน จุดแสงขนาดเล็กที่มีโครงร่างที่ชัดเจนจะเกิดขึ้นบนระนาบโฟกัส ประกอบด้วยตัวแยกลำแสง ตัวแยกลำแสงจะส่งสารเรืองแสงไปยังเครื่องตรวจจับโดยตรง มีรูเข็มอยู่ด้านหน้าของแหล่งกำเนิดแสงและตัวตรวจจับ ซึ่งเรียกว่ารูเข็มส่องสว่างและรูเข็มตรวจจับตามลำดับ ขนาดทางเรขาคณิตของทั้งสองเหมือนกัน ประมาณ 100-200 นาโนเมตร; เมื่อเทียบกับจุดแสงบนระนาบโฟกัส ทั้งสองจะเชื่อมต่อกัน กล่าวคือ จุดแสงจะผ่านชุดเลนส์ และสุดท้ายสามารถโฟกัสไปที่รูเข็มส่องสว่างและรูเข็มตรวจจับได้พร้อมกัน ด้วยวิธีนี้ แสงจากระนาบโฟกัสสามารถกระจุกตัวอยู่ภายในช่วงของรูตรวจจับ ในขณะที่แสงที่กระจัดกระจายจากด้านบนหรือด้านล่างของระนาบโฟกัสจะถูกบังออกจากรูตรวจจับและไม่สามารถถ่ายภาพได้ ตัวอย่างจะถูกสแกนแบบจุดต่อจุดด้วยเลเซอร์ และหลอดโฟโตมัลติพลายเออร์หลังจากตรวจจับรูเข็มยังได้ภาพคอนโฟคอลของจุดแสงที่สอดคล้องกันแบบจุดต่อจุด ซึ่งจะถูกแปลงเป็นสัญญาณดิจิทัลและส่งไปยังคอมพิวเตอร์ หน้าจอเป็นภาพคอนโฟคอลที่ชัดเจนของระนาบโฟกัสทั้งหมด .
ภาพระนาบโฟกัสแต่ละภาพเป็นภาพตัดขวางเชิงแสงของชิ้นงานทดสอบ และภาพตัดขวางเชิงแสงนี้จะมีความหนาที่แน่นอนเสมอ หรือที่เรียกว่าชิ้นเลนส์ เนื่องจากความเข้มของแสงที่จุดโฟกัสจะมากกว่าที่จุดที่ไม่ใช่โฟกัส และแสงระนาบที่ไม่โฟกัสจะถูกกรองออกโดยรูเข็ม ระยะชัดลึกของระบบคอนโฟคอลจึงอยู่ที่ประมาณศูนย์ และการสแกนตามแนว แกน Z สามารถรับการตรวจเอกซเรย์ด้วยแสงได้ โดยสร้างส่วนสังเกตการณ์สองมิติที่จุดโฟกัสของตัวอย่าง เมื่อรวมการสแกนระนาบ XY (ระนาบโฟกัส) เข้ากับการสแกนแกน Z (แกนออปติคัล) โดยการรวบรวมภาพสองมิติของเลเยอร์ที่ต่อเนื่องกันและการประมวลผลด้วยซอฟต์แวร์คอมพิวเตอร์พิเศษ จะได้ภาพสามมิติของตัวอย่าง
นั่นคือ รูเข็มตรวจจับและรูเข็มแหล่งกำเนิดแสงจะโฟกัสที่จุดเดียวกันเสมอ ดังนั้นสารเรืองแสงที่กระตุ้นภายนอกระนาบโฟกัสจะไม่สามารถเข้าไปในรูเข็มตรวจจับได้
การแสดงออกอย่างง่ายของหลักการทำงานของคอนโฟคอลเลเซอร์คือใช้เลเซอร์เป็นแหล่งกำเนิดแสง และบนพื้นฐานของการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบดั้งเดิม มีการติดอุปกรณ์การสแกนด้วยเลเซอร์และอุปกรณ์โฟกัสแบบคอนจูเกต และการได้มาและการประมวลผลภาพดิจิทัล ระบบควบคุมด้วยคอมพิวเตอร์
