การนับจำนวนโดยตรงด้วยกล้องจุลทรรศน์สำหรับจุลินทรีย์
หลักการทดลอง
การนับจำนวนโดยตรงภายใต้กล้องจุลทรรศน์โดยใช้เครื่องวัดปริมาณเลือดเป็นวิธีการนับจำนวนจุลินทรีย์ที่ใช้กันทั่วไป ข้อดีของวิธีนี้คือใช้งานง่ายและรวดเร็ว วางสารแขวนลอยแบคทีเรียที่เจือจางอย่างเหมาะสม (หรือสารแขวนลอยสปอร์) ในช่องนับระหว่างสไลด์กับกระจกครอบของเครื่องวัดค่าเม็ดเลือด และนับจำนวนด้วยกล้องจุลทรรศน์ เนื่องจากปริมาตรของห้องนับคงที่ (0.1 มม.2) จึงสามารถแปลงเป็นจำนวนจุลินทรีย์ทั้งหมดต่อหน่วยปริมาตรตามจำนวนของจุลินทรีย์ที่สังเกตได้ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ เนื่องจากวิธีการนี้นับผลรวมของแบคทีเรียที่มีชีวิตและตายแล้ว จึงเรียกอีกอย่างว่าวิธีการนับจำนวนแบคทีเรียทั้งหมด
เครื่องวัดปริมาณเม็ดเลือดมักจะเป็นสไลด์แก้วพิเศษซึ่งมีสี่ร่องประกอบเป็นสามแท่น แพลตฟอร์มตรงกลางแบ่งออกเป็นสองส่วนโดยร่องแนวนอนสั้น ๆ มีการสลักตารางไว้บนแท่นในแต่ละด้าน แต่ละตารางแบ่งออกเป็นเก้าช่องสี่เหลี่ยมขนาดใหญ่ ลานกว้างตรงกลางเป็นห้องนับ จุลินทรีย์จะถูกนับในห้องนับ โครงสร้างของแผงนับเซลล์เม็ดเลือดแสดงในรูปที่ Ⅷ-1
มาตราส่วนของห้องนับโดยทั่วไปมีข้อกำหนดสองประการ ข้อหนึ่งคือ สี่เหลี่ยมขนาดใหญ่แบ่งออกเป็นสี่เหลี่ยมตรงกลาง 16 อัน และสี่เหลี่ยมตรงกลางแต่ละอันแบ่งออกเป็นสี่เหลี่ยมเล็ก ๆ 25 อัน (รูปที่ Ⅷ-2) อีกอันคือสี่เหลี่ยมขนาดใหญ่ สี่เหลี่ยมแบ่งออกเป็นสี่เหลี่ยมตรงกลาง 25 อัน และแต่ละอันตรงกลางแบ่งเป็นสี่เหลี่ยมเล็ก ๆ 16 อัน (รูปที่ Ⅷ-1, C) แต่ไม่ว่าจะเป็นกระดานนับแบบใด จำนวนสี่เหลี่ยมเล็กในแต่ละสี่เหลี่ยมใหญ่จะเท่ากัน นั่นคือ 16×25=400 สี่เหลี่ยมเล็ก ดังแสดงในรูปที่ Ⅷ-2
ความยาวด้านของสี่เหลี่ยมขนาดใหญ่แต่ละอันคือ 1 มม. และพื้นที่ของสี่เหลี่ยมจัตุรัสขนาดใหญ่แต่ละอันคือ 1 มม.2 หลังจากปิดกระจกครอบแล้ว ความสูงระหว่างกระจกสไลด์และกระจกครอบคือ 0.1 มม. ดังนั้นปริมาตรของห้องนับคือ 0.1 มม.3
เวลานับ ปกติจะนับจำนวนแบคทีเรียทั้งหมดในช่องสี่เหลี่ยมตรงกลางทั้ง 5 ช่อง แล้วหาค่าเฉลี่ยของช่องตรงกลางแต่ละช่อง แล้วคูณด้วย 16 หรือ 25 ก็จะได้จำนวนแบคทีเรียทั้งหมดในช่องสี่เหลี่ยมขนาดใหญ่ แล้วแปลงเป็น จำนวนแบคทีเรียทั้งหมดในสารละลายแบคทีเรีย 1 มล.
อุปกรณ์ห้องปฏิบัติการ
เครื่องวัดเม็ดเลือด, กล้องจุลทรรศน์, แผ่นปิด, เส้นเลือดฝอยที่ปราศจากเชื้อ;
วัสดุทดลอง
Saccharomyces cerevisiae ระงับ
ขั้นตอนการทดลอง (วิธีการนับจำนวนจุลินทรีย์ด้วยกล้องจุลทรรศน์โดยตรง)
1. การเจือจาง
เจือจางสารแขวนลอย Saccharomyces cerevisiae อย่างเหมาะสม หากสารละลายแบคทีเรียไม่ข้นก็ไม่จำเป็นต้องเจือจาง
2. ห้องตรวจนับด้วยกล้องจุลทรรศน์
ก่อนเติมตัวอย่าง ให้ทำการตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์ของห้องนับของจานนับ หากมีสิ่งสกปรกต้องทำความสะอาดก่อนนับ
3. เพิ่มตัวอย่าง
ปิดแผ่นเครื่องวัดปริมาณเลือดในเลือดที่สะอาดและแห้งด้วยกระจกครอบ จากนั้นใช้หลอดหยดแบบปากละเอียดที่ปราศจากเชื้อเพื่อหยดสารละลาย Saccharomyces cerevisiae ที่เจือจางแล้วเล็กน้อยจากขอบของกระจกฝาครอบ (ไม่มากจนเกินไป) เพื่อให้สารละลายแบคทีเรีย อยู่ใกล้กับช่องว่างตามช่องว่าง การออสโมซิสของเส้นเลือดฝอยจะเข้าสู่ห้องนับด้วยตัวมันเอง และห้องนับทั่วไปสามารถเติมของเหลวจากแบคทีเรียได้ ระวังอย่าให้มีฟองอากาศ
4. การตรวจนับด้วยกล้องจุลทรรศน์
หลังจากพักเป็นเวลา 5 นาที ให้วางฮีโมไซโทมิเตอร์ไว้บนเวทีของกล้องจุลทรรศน์ ขั้นแรกให้ใช้เลนส์กำลังต่ำเพื่อค้นหาตำแหน่งของห้องตรวจนับ แล้วจึงเปลี่ยนไปใช้เลนส์กำลังสูงเพื่อตรวจนับ หากพบว่าสารละลายแบคทีเรียหนาหรือบางเกินไปก่อนนับ จำเป็นต้องปรับการเจือจางอีกครั้งก่อนนับ โดยทั่วไป การเจือจางตัวอย่างต้องใช้แบคทีเรียประมาณ 5-10 เซลล์ในแต่ละเซลล์ ห้องตรวจนับแต่ละห้องจะเลือกแบคทีเรียในตะแกรงกลาง 5 ช่อง (เลือกมุม 4 มุมและตะแกรงกลาง) เพื่อทำการนับ แบคทีเรียบนเส้นกริดโดยทั่วไปจะนับเฉพาะบนเส้นบนและขวาเท่านั้น ในกรณีของยีสต์ที่กำลังแตกหน่อ เมื่อขนาดของหน่อถึงครึ่งหนึ่งของเซลล์แม่ ให้นับแบคทีเรียสองตัว นับตัวอย่างเพื่อคำนวณปริมาณแบคทีเรียของตัวอย่างจากค่าที่นับในช่องนับสองช่อง
5. การทำความสะอาดเครื่องวัดปริมาณเลือด
หลังการใช้งาน ให้ล้างจานนับเซลล์เม็ดเลือดที่ก๊อกน้ำด้วยการฉีดน้ำ ห้ามล้างด้วยวัตถุแข็ง และเช็ดให้แห้งด้วยตัวเองหรือด้วยเครื่องเป่าผมหลังล้าง การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์สังเกตว่ามีแบคทีเรียหรือตะกอนอื่น ๆ หลงเหลืออยู่ในแต่ละเซลล์หรือไม่ หากไม่สะอาดต้องล้างซ้ำจนกว่าจะสะอาด
