การประยุกต์ใช้และการใช้หลักการของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์
(1) หลักการและลักษณะโครงสร้างของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์: กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ใช้แหล่งกำเนิดแสงแบบจุดที่มีประสิทธิภาพการส่องสว่างสูงเพื่อปล่อยแสงที่มีความยาวคลื่นบางช่วง (เช่น แสงอัลตราไวโอเลต 3650 นิ้ว หรือแสงสีม่วงสีน้ำเงิน 4200 นิ้ว) ผ่านระบบกรอง เป็นแสงกระตุ้นเพื่อกระตุ้นชิ้นงาน หลังจากที่สารเรืองแสงที่อยู่ภายในปล่อยแสงเรืองแสงออกมาเป็นสีต่างๆ จะสังเกตได้ผ่านการขยายของเลนส์ใกล้วัตถุและช่องมองภาพ ด้วยวิธีนี้ ภายใต้พื้นหลังที่มีคอนทราสต์สูง แม้ว่าแสงฟลูออเรสเซนต์จะอ่อนมาก แต่ก็สามารถระบุได้ง่ายและมีความไวสูง ส่วนใหญ่จะใช้สำหรับการวิจัยโครงสร้างและหน้าที่ของเซลล์และองค์ประกอบทางเคมี โครงสร้างพื้นฐานของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ประกอบด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงธรรมดาพร้อมอุปกรณ์เสริมบางอย่าง (เช่น แหล่งกำเนิดแสงฟลูออเรสเซนต์ ฟิลเตอร์กระตุ้น ตัวแยกลำแสงสองสี และฟิลเตอร์บล็อค ฯลฯ) แหล่งกำเนิดแสงฟลูออเรสเซนต์ - โดยทั่วไปจะใช้หลอดปรอทความดันสูงพิเศษ (50-200W) ซึ่งสามารถเปล่งแสงที่มีความยาวคลื่นต่างๆ ได้ แต่สารฟลูออเรสเซนต์แต่ละชนิดมีความยาวคลื่นกระตุ้นที่ทำให้เกิดการเรืองแสงที่เข้มที่สุด ดังนั้นตัวกรองการกระตุ้น ( โดยทั่วไป มีฟิลเตอร์กระตุ้นรังสีอัลตราไวโอเลต สีม่วง สีน้ำเงิน และสีเขียว) ซึ่งอนุญาตให้เฉพาะแสงกระตุ้นที่มีความยาวคลื่นบางช่วงเท่านั้นที่จะผ่านและฉายรังสีชิ้นงานได้ในขณะที่ดูดซับแสงอื่น ๆ หลังจากที่สารแต่ละชนิดถูกฉายรังสีด้วยแสงกระตุ้น มันจะปล่อยแสงเรืองแสงที่มองเห็นได้ซึ่งมีความยาวคลื่นยาวกว่าความยาวคลื่นของการฉายรังสีในเวลาอันสั้นมาก แสงฟลูออเรสเซนต์มีความเฉพาะเจาะจงและโดยทั่วไปจะอ่อนกว่าแสงกระตุ้น ในการสังเกตการเรืองแสงที่เฉพาะเจาะจง จำเป็นต้องใช้ฟิลเตอร์ปิดกั้น (หรือระงับ) ด้านหลังเลนส์ใกล้วัตถุ มีสองหน้าที่: หนึ่งคือการดูดซับและปิดกั้นแสงกระตุ้นไม่ให้เข้าสู่ช่องมองภาพ เพื่อไม่ให้รบกวนการเรืองแสงและทำให้ดวงตาเสียหาย อีกประการหนึ่งคือการเลือกและปล่อยให้ฟลูออเรสเซนต์เฉพาะเจาะจงผ่านไปเพื่อแสดงสีฟลูออเรสเซนต์เฉพาะ ต้องใช้ตัวกรองทั้งสองร่วมกัน
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์มีสองประเภทในแง่ของเส้นทางแสง:
1. กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบส่องผ่าน: แหล่งกำเนิดแสงกระตุ้นจะถูกส่งผ่านวัสดุตัวอย่างผ่านเลนส์คอนเดนเซอร์เพื่อกระตุ้นการเรืองแสง โดยทั่วไปจะใช้ตัวสะสมสนามมืด และตัวสะสมแบบธรรมดายังสามารถใช้เพื่อปรับกระจกเพื่อให้แสงกระตุ้นถูกเปลี่ยนเส้นทางและบายพาสไปยังชิ้นงานทดสอบ นี่คือกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์รุ่นเก่า ข้อดีก็คือการเรืองแสงมีความเข้มสูงเมื่อใช้กำลังขยายต่ำ แต่ข้อเสียคือการเรืองแสงจะลดลงตามการขยายที่เพิ่มขึ้น ดังนั้นจึงควรสังเกตวัสดุตัวอย่างที่มีขนาดใหญ่กว่า
2. กล้องจุลทรรศน์อีพิฟลูออเรสเซนซ์เป็นกล้องจุลทรรศน์ชนิดเรืองแสงชนิดใหม่ที่พัฒนาขึ้นในยุคปัจจุบัน ความแตกต่างก็คือแสงกระตุ้นตกจากเลนส์ใกล้วัตถุไปยังพื้นผิวของชิ้นงานทดสอบ กล่าวคือ เลนส์ใกล้วัตถุตัวเดียวกันนั้นถูกใช้เป็นคอนเดนเซอร์ส่องสว่างและเลนส์ใกล้วัตถุสำหรับรวบรวมสารเรืองแสง จำเป็นต้องเพิ่มตัวแยกลำแสงไดโครอิกในเส้นทางแสง ซึ่งอยู่ห่างจากยูเรเนียมเบา 45 องศา แสงกระตุ้นจะสะท้อนเข้าสู่เลนส์ใกล้วัตถุและสะสมบนตัวอย่าง แสงเรืองแสงที่สร้างโดยตัวอย่างและแสงกระตุ้นที่สะท้อนโดยพื้นผิวเลนส์ของเลนส์ใกล้วัตถุและพื้นผิวกระจกฝาครอบเข้าสู่เลนส์ใกล้วัตถุในเวลาเดียวกัน และกลับไปที่ตัวแยกลำแสงสองสีเพื่อทำให้แสงกระตุ้นแยกออกจากเรืองแสง แสงกระตุ้นที่เหลือจะถูกดูดซับโดยการปิดกั้นตัวกรอง เช่นการเปลี่ยนไปใช้ตัวกรองการกระตุ้น/ตัวแยกลำแสงสองสี/ตัวกรองการบล็อกที่แตกต่างกัน สามารถตอบสนองความต้องการของผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาเรืองแสงที่แตกต่างกัน ข้อดีของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ประเภทนี้คือ การส่องสว่างของขอบเขตการมองเห็นสม่ำเสมอ การถ่ายภาพมีความชัดเจน และยิ่งกำลังขยายมากเท่าใด แสงฟลูออเรสเซนต์ก็จะยิ่งแข็งแกร่งขึ้นเท่านั้น
(2) วิธีใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์
1. เปิดแหล่งกำเนิดแสงและหลอดปรอทความดันสูงพิเศษจะต้องอุ่นเครื่องสักครู่เพื่อให้ถึงจุดที่สว่างที่สุด
2. กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบส่องผ่านจำเป็นต้องติดตั้งตัวกรองการกระตุ้นที่จำเป็นระหว่างแหล่งกำเนิดแสงและคอนเดนเซอร์ และติดตั้งตัวกรองการปิดกั้นที่สอดคล้องกันด้านหลังเลนส์ใกล้วัตถุ กล้องจุลทรรศน์อีพิฟลูออเรสเซนซ์จำเป็นต้องใส่ฟิลเตอร์กระตุ้น/ตัวแยกลำแสงสองสี/ฟิลเตอร์บล็อคที่จำเป็นเข้าไปในช่องในเส้นทางแสง
3. สังเกตด้วยเลนส์ที่มีกำลังขยายต่ำ และปรับจุดศูนย์กลางของแหล่งกำเนิดแสงให้อยู่ตรงกลางจุดส่องสว่างทั้งหมดตามอุปกรณ์ปรับของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์รุ่นต่างๆ
4. วางชิ้นตัวอย่างแล้วสังเกตหลังจากโฟกัสแล้ว ควรให้ความสนใจระหว่างการใช้งาน: อย่าสังเกตโดยตรงกับตัวกรองปลาย เพื่อไม่ให้เกิดความเสียหายต่อดวงตา เมื่อสังเกตชิ้นงานด้วยเลนส์น้ำมัน ต้องใช้เลนส์น้ำมันพิเศษที่ไม่มีสารเรืองแสง หลังจากปิดหลอดปรอทความดันสูงแล้วไม่สามารถเปิดใหม่ได้ทันทีต้องทดสอบ สามารถรีสตาร์ทได้หลังจากผ่านไป 5 นาที มิฉะนั้นจะไม่เสถียรและส่งผลต่ออายุการใช้งานของหลอดปรอท
(3) สังเกตเซลล์ที่ย้อมด้วยสีย้อมฟลูออเรสเซนต์สีส้มอะคริดีน 0.01 เปอร์เซ็นต์ ใต้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์บนแท่นการสอนที่มีตัวกรองแสงสีน้ำเงิน-ม่วง นิวเคลียสและไซโตพลาสซึมรู้สึกตื่นเต้นที่จะผลิตสีเรืองแสงสองสีที่แตกต่างกัน (สีเขียวเข้มและสีส้มแดง)
