กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แตกต่างจากกล้องจุลทรรศน์ทั่วไป
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ใช้แสงอัลตราไวโอเลตเป็นแหล่งกำเนิดแสงในการฉายรังสีวัตถุที่จะตรวจสอบ เพื่อให้วัตถุนั้นปล่อยแสงออกมา จากนั้นจึงสังเกตวัตถุที่อยู่ใต้กล้องจุลทรรศน์ ส่วนใหญ่จะใช้สำหรับเซลล์อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ โดยส่วนใหญ่ประกอบด้วยแหล่งกำเนิดแสง ระบบแผ่นกรอง และระบบออพติคัลเพื่อสังเกตภาพฟลูออเรสเซนต์ของตัวอย่างผ่านการขยายของช่องมองภาพและเลนส์ใกล้วัตถุ เรามาดูความแตกต่างระหว่างกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์นี้กับกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงทั่วไปกันดีกว่า
1. ดูวิธีการจัดแสง
วิธีการส่องสว่างของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์โดยทั่วไปเป็นแบบ episcopic กล่าวคือ แหล่งกำเนิดแสงจะถูกฉายบนตัวอย่างทดสอบผ่านเลนส์ใกล้วัตถุ
2. ดูความละเอียด
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ใช้แสงอัลตราไวโอเลตเป็นแหล่งกำเนิดแสง และความยาวคลื่นค่อนข้างสั้น แต่ความละเอียดสูงกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงทั่วไป
3.ข้อแตกต่างของไส้กรอง
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ใช้ฟิลเตอร์พิเศษสองตัว ซึ่งใช้ด้านหน้าแหล่งกำเนิดแสงเพื่อกรองแสงที่มองเห็น และใช้ระหว่างเลนส์ใกล้วัตถุและช่องมองภาพเพื่อกรองรังสีอัลตราไวโอเลต ซึ่งสามารถปกป้องดวงตาของมนุษย์ได้
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ก็เป็นกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงชนิดหนึ่ง เนื่องจากความยาวคลื่นที่ตื่นเต้นโดยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์นั้นสั้น ดังนั้นสิ่งนี้จึงนำไปสู่ความแตกต่างในโครงสร้างและการใช้งานระหว่างกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์และกล้องจุลทรรศน์ธรรมดา กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ส่วนใหญ่มีหน้าที่จับแสงที่อ่อนได้ดี ดังนั้นภายใต้การเรืองแสงที่อ่อนมาก ความสามารถในการถ่ายภาพก็ดีเช่นกัน เมื่อประกอบกับการปรับปรุงกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์อย่างต่อเนื่องในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา สัญญาณรบกวนก็ลดลงอย่างมากเช่นกัน จึงมีการใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์เพิ่มมากขึ้น
คู่
ความรู้เกี่ยวกับกล้องจุลทรรศน์โฟตอนเรืองแสง
หลักการพื้นฐานของการกระตุ้นด้วยโฟตอนแบบสองโฟตอนคือ: ในกรณีที่ความหนาแน่นของโฟตอนสูง โมเลกุลของฟลูออเรสเซนต์สามารถดูดซับโฟตอนความยาวคลื่นยาวสองตัวในเวลาเดียวกัน และปล่อยโฟตอนที่มีความยาวคลื่นสั้นกว่าหลังจากช่วงเวลาสั้น ๆ ที่เรียกว่าอายุการใช้งานในสภาวะตื่นเต้น เอฟเฟกต์จะเหมือนกับการใช้โฟตอนที่มีความยาวคลื่นครึ่งหนึ่งของความยาวคลื่นยาวเพื่อกระตุ้นโมเลกุลของฟลูออเรสเซนต์ การกระตุ้นแบบสองโฟตอนต้องใช้ความหนาแน่นของโฟตอนสูง เพื่อไม่ให้เซลล์เสียหาย กล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอนจึงใช้เลเซอร์พัลส์ที่ล็อคโหมดพลังงานสูง เลเซอร์ที่ปล่อยออกมาจากเลเซอร์นี้มีพลังงานสูงสุดสูงและพลังงานเฉลี่ยต่ำ ความกว้างของพัลส์คือเพียง 100 เฟมโตวินาที และความถี่สามารถเข้าถึง 80 ถึง 100 เมกะเฮิรตซ์ เมื่อใช้เลนส์ใกล้วัตถุที่มีรูรับแสงเป็นตัวเลขสูงเพื่อโฟกัสโฟตอนของเลเซอร์พัลซิ่ง ความหนาแน่นของโฟตอนที่จุดโฟกัสของเลนส์ใกล้วัตถุจะสูงที่สุด และการกระตุ้นสองโฟตอนจะเกิดขึ้นที่จุดโฟกัสของเลนส์ใกล้วัตถุเท่านั้น ดังนั้น กล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอนไม่จำเป็นต้องใช้รูเข็มคอนโฟคอล ซึ่งช่วยเพิ่มประสิทธิภาพการตรวจจับเรืองแสง
ในปรากฏการณ์การเรืองแสงโดยทั่วไป เนื่องจากความหนาแน่นของโฟตอนที่ต่ำของแสงกระตุ้น โมเลกุลของฟลูออเรสเซนต์จึงสามารถดูดซับโฟตอนได้เพียงโฟตอนเดียวในเวลาเดียวกัน จากนั้นจึงปล่อยโฟตอนฟลูออเรสเซนต์ออกมาผ่านการเปลี่ยนผ่านของการแผ่รังสี ซึ่งเป็นการเรืองแสงแบบโฟตอนเดี่ยว สำหรับกระบวนการกระตุ้นการเรืองแสงโดยใช้เลเซอร์เป็นแหล่งกำเนิดแสง อาจเกิดการเรืองแสงแบบสองโฟตอนหรือหลายโฟตอนได้ ในเวลานี้ ความเข้มของแหล่งกำเนิดแสงกระตุ้นที่ใช้อยู่ในระดับสูง และความหนาแน่นของโฟตอนเป็นไปตามข้อกำหนดของโมเลกุลฟลูออเรสเซนต์ที่ดูดซับโฟตอนสองตัวในเวลาเดียวกัน ในกระบวนการใช้เลเซอร์ทั่วไปเป็นแหล่งกำเนิดแสงกระตุ้น ความหนาแน่นของโฟตอนยังไม่เพียงพอที่จะสร้างปรากฏการณ์การดูดกลืนแสงแบบสองโฟตอน โดยปกติแล้ว จะใช้เลเซอร์พัลซิ่งเฟมโตวินาที และพลังงานที่เกิดขึ้นทันทีสามารถเข้าถึงลำดับเมกะวัตต์ได้ ดังนั้น ความยาวคลื่นของแสงเรืองแสงแบบสองโฟตอนจึงสั้นกว่าความยาวคลื่นของแสงกระตุ้น ซึ่งเทียบเท่ากับผลกระทบที่เกิดจากการกระตุ้นที่ครึ่งหนึ่งของความยาวคลื่นกระตุ้น
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบสองโฟตอนมีข้อดีหลายประการ:
1) แสงความยาวคลื่นยาวได้รับผลกระทบจากการกระเจิงน้อยกว่าแสงความยาวคลื่นสั้น และทะลุผ่านชิ้นงานทดสอบได้ง่าย
2) โมเลกุลของฟลูออเรสเซนต์ที่อยู่นอกระนาบโฟกัสจะไม่ถูกกระตุ้น เพื่อให้แสงกระตุ้นสามารถเข้าถึงระนาบโฟกัสได้มากขึ้น เพื่อให้แสงกระตุ้นสามารถเจาะชิ้นงานที่ลึกลงไปได้
3) แสงอินฟราเรดใกล้ความยาวคลื่นยาวเป็นพิษต่อเซลล์น้อยกว่าแสงความยาวคลื่นสั้น
4) เมื่อใช้กล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอนเพื่อสังเกตชิ้นงาน การฟอกสีด้วยแสงและความเป็นพิษต่อแสงจะเกิดขึ้นเฉพาะในระนาบโฟกัสเท่านั้น ดังนั้น กล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอนจึงเหมาะสมกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบโฟตอนเดี่ยวสำหรับการสังเกตตัวอย่างที่มีความหนา สำหรับการสังเกตเซลล์ที่มีชีวิต หรือสำหรับการทดลองการฟอกสีด้วยแสงเฉพาะจุด
ความรู้เกี่ยวกับกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์คอนโฟคอล
หลักการพื้นฐานของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบคอนโฟคอล: ตัวอย่างจะถูกฉายรังสีด้วยแหล่งกำเนิดแสงแบบจุด และจุดไฟขนาดเล็กที่มีการกำหนดไว้อย่างดีจะถูกสร้างขึ้นบนระนาบโฟกัส หลังจากจุดนั้นถูกฉายรังสี แสงฟลูออเรสเซนต์ที่ปล่อยออกมาจะถูกรวบรวมโดยเลนส์ใกล้วัตถุ และส่งกลับไปยังตัวแยกลำแสงที่ประกอบด้วยกระจกไดโครอิกตามเส้นทางการส่องสว่างดั้งเดิม ตัวแยกลำแสงจะส่งแสงฟลูออเรสเซนต์ไปยังเครื่องตรวจจับโดยตรง มีรูเข็มอยู่ด้านหน้าแหล่งกำเนิดแสงและเครื่องตรวจจับ ตามลำดับเรียกว่ารูเข็มส่องสว่างและรูเข็มตรวจจับ ขนาดทางเรขาคณิตของทั้งสองมีค่าเท่ากัน ประมาณ 100-200นาโนเมตร สัมพันธ์กับจุดแสงบนระนาบโฟกัส ทั้งสองเป็นแบบคอนจูเกต กล่าวคือ จุดแสงผ่านชุดเลนส์ และในที่สุดก็สามารถโฟกัสไปที่รูเข็มส่องสว่างและรูเข็มตรวจจับได้ในเวลาเดียวกัน ด้วยวิธีนี้ แสงจากระนาบโฟกัสจึงสามารถมาบรรจบกันภายในขอบเขตของรูตรวจจับได้ ในขณะที่แสงที่กระเจิงจากด้านบนหรือด้านล่างระนาบโฟกัสจะถูกบังไว้ด้านนอกรูตรวจจับและไม่สามารถถ่ายภาพได้ เลเซอร์จะสแกนตัวอย่างทีละจุด และหลอดโฟโตมัลติพลายเออร์หลังจากตรวจพบรูเข็มยังได้รับภาพคอนโฟคอลของจุดแสงที่สอดคล้องกันทีละจุด ซึ่งจะถูกแปลงเป็นสัญญาณดิจิทัลและส่งไปยังคอมพิวเตอร์ และสุดท้ายก็รวมเข้าด้วยกันเป็นที่ชัดเจน ภาพคอนโฟคอลของระนาบโฟกัสทั้งหมดบนหน้าจอ
ภาพระนาบโฟกัสแต่ละภาพจริงๆ แล้วเป็นภาพตัดขวางทางแสงของชิ้นงานทดสอบ และภาพตัดขวางทางแสงนี้จะมีความหนาที่แน่นอนเสมอ หรือที่เรียกว่าส่วนบางทางแสง เนื่องจากความเข้มของแสงที่จุดโฟกัสนั้นมากกว่าความเข้มของจุดที่ไม่ใช่โฟกัสมาก และแสงระนาบที่ไม่ใช่โฟกัสจะถูกกรองออกโดยรูเข็ม ระยะชัดลึกของระบบคอนโฟคอลจึงอยู่ที่ประมาณศูนย์ และการสแกนไปตาม แกน Z สามารถรับรู้เอกซเรย์ด้วยแสง ซึ่งสร้างชิ้นแสงสองมิติที่จุดที่โฟกัสของตัวอย่างที่จะสังเกต เมื่อรวมการสแกนระนาบ XY (ระนาบโฟกัส) เข้ากับการสแกนแกน Z (แกนออปติคอล) จะทำให้ได้ภาพสามมิติของตัวอย่างโดยการสะสมภาพสองมิติของชั้นต่อเนื่องกัน และประมวลผลโดยซอฟต์แวร์คอมพิวเตอร์พิเศษ
นั่นคือรูเข็มตรวจจับและรูเข็มของแหล่งกำเนิดแสงจะโฟกัสที่จุดเดียวกันเสมอ ดังนั้นแสงฟลูออเรสเซนต์ที่ตื่นเต้นอยู่นอกระนาบโฟกัสไม่สามารถเข้าไปในรูเข็มตรวจจับได้
หลักการทำงานของคอนโฟคอลเลเซอร์คือการใช้แสงเลเซอร์เป็นแหล่งกำเนิดแสง บนพื้นฐานของการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบดั้งเดิมนั้น ได้เพิ่มอุปกรณ์สแกนด้วยเลเซอร์และอุปกรณ์โฟกัสแบบคอนจูเกต และเป็นระบบสำหรับการรับและประมวลผลภาพดิจิทัลผ่านการควบคุมด้วยคอมพิวเตอร์
