สัณฐานวิทยาของเซลล์จุลินทรีย์สังเกตได้อย่างไรภายใต้กล้องจุลทรรศน์?
กล้องจุลทรรศน์ถูกประดิษฐ์ขึ้นเพื่อดูวัตถุที่มีรอยยิ้มซึ่งไม่สามารถมองเห็นได้ด้วยตาเปล่า จุลินทรีย์มีขนาดเล็กมาก จึงต้องขยายและสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์ นอกจากนี้ ยังมีจุลินทรีย์อีกหลายชนิด ดังนั้น โดยทั่วไปแล้ว กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงส่วนใหญ่จึงสามารถสังเกตจุลินทรีย์ได้ คำถามต่อไปคือควรใช้กล้องจุลทรรศน์ชนิดใดในการสังเกตและวิเคราะห์จุลินทรีย์ชนิดใด กล้องจุลทรรศน์ทั่วไปที่สามารถใช้เพื่อสังเกตสัณฐานวิทยาของจุลินทรีย์ ได้แก่ กล้องจุลทรรศน์ชีวภาพ กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล กล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัว กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล ฯลฯ
ต่อไปนี้จะอธิบายกล้องจุลทรรศน์ชนิดต่างๆ ที่ใช้ในการสังเกตจุลินทรีย์:
1. กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงทั่วไปใช้แสงธรรมชาติหรือแสงเป็นแหล่งกำเนิดแสง และความยาวคลื่นประมาณ 0.4 μm ความละเอียดของกล้องจุลทรรศน์คือครึ่งหนึ่งของความยาวคลื่น ซึ่งก็คือ 0.2 μm และภาพที่เล็กที่สุดที่มองเห็นได้ด้วยตาเปล่าคือ 0.2 มม. ดังนั้น การใช้กระจกเงาน้ำมัน (แบบจุ่ม) เพื่อขยาย 1000 เท่าสามารถขยายอนุภาค 0.2μm ให้เป็น 0.2 มม. ที่มองเห็นได้ด้วยตาเปล่า กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงทั่วไปสามารถใช้ในการสังเกตแบคทีเรีย แอกติโนไมซีต และเชื้อราได้
2. กล้องจุลทรรศน์ Darkfield มักใช้เพื่อสังเกตสัณฐานวิทยาและการเคลื่อนไหวของจุลินทรีย์ที่ไม่มีสี หลังจากติดตั้งคอนเดนเซอร์สนามมืดในกล้องจุลทรรศน์ธรรมดาแล้ว แสงจะไม่สามารถทะลุผ่านจากตรงกลางได้โดยตรง และขอบเขตการมองเห็นจะมืด เมื่อชิ้นงานได้รับแสงเฉียงจากขอบคอนเดนเซอร์ ก็สามารถกระเจิงได้ จึงสามารถสังเกตเห็นจุลินทรีย์ที่มีความสว่าง เช่น แบคทีเรียหรือสไปโรเชตในพื้นหลังสนามมืดได้
3. กล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์เฟส กล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์เฟสใช้เอฟเฟกต์แสงของแผ่นปรับเฟสเพื่อเปลี่ยนเฟสแสงและแอมพลิจูดของแสงตรง และแปลงความแตกต่างของเฟสแสงให้เป็นความแตกต่างของความเข้มของแสง ภายใต้กล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์เฟส เมื่อแสงผ่านชิ้นงานที่ไม่มีรอยเปื้อน ความแตกต่างของเฟสแสงจะเกิดจากความหนาแน่นของส่วนต่างๆ ของชิ้นงานทดสอบไม่สอดคล้องกัน และสามารถสังเกตลักษณะทางสัณฐานวิทยา โครงสร้างภายใน และรูปแบบการเคลื่อนที่ของจุลินทรีย์ได้
4. กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์โดยพื้นฐานแล้วเหมือนกับกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงทั่วไป ความแตกต่างที่สำคัญคือแหล่งกำเนิดแสง ฟิลเตอร์ และคอนเดนเซอร์ ปัจจุบันส่วนใหญ่ใช้อุปกรณ์อีพิไลท์ และหลอดปรอทความดันสูงมักใช้เป็นแหล่งกำเนิดแสง ซึ่งสามารถปล่อยแสงอัลตราไวโอเลตหรือแสงสีน้ำเงินม่วงได้ ตัวกรองมีสองประเภท: ตัวกรองการกระตุ้นและตัวกรองการดูดซึม นอกจากคอนเดนเซอร์สนามสว่างทั่วไปแล้ว คอนเดนเซอร์สนามมืดยังสามารถใช้ในกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์โดยใช้แสงสีน้ำเงินเพื่อเพิ่มความแตกต่างระหว่างฟลูออเรสเซนต์และพื้นหลัง วิธีการนี้ใช้ได้กับการตรวจจับหรือระบุแบคทีเรียที่เปื้อนด้วยเม็ดสีเรืองแสงหรือรวมกับแอนติบอดี้เรืองแสง
5. กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนใช้การไหลของอิเล็กตรอนเป็นแหล่งกำเนิดแสง และความยาวคลื่นแตกต่างจากแสงที่มองเห็นได้หลายหมื่นเท่า ซึ่งช่วยปรับปรุงความละเอียดได้อย่างมาก นอกจากนี้ยังใช้ขดลวดแม่เหล็กเป็นระบบขยายแสง และกำลังขยายสามารถเข้าถึงได้นับหมื่นหรือหลายแสนครั้ง มักใช้สำหรับการสังเกตอนุภาคไวรัสและโครงสร้างพื้นฐานของแบคทีเรีย
การสังเกตตัวอย่างจุลินทรีย์ที่ไม่มีรอยเปื้อน:
โดยทั่วไปตัวอย่างที่ไม่มีรอยเปื้อนสามารถใช้เพื่อสังเกตสัณฐานวิทยา พลังงาน และการเคลื่อนไหวของแบคทีเรียได้ แบคทีเรียไม่มีสีและโปร่งใสเมื่อไม่มีรอยเปื้อน และตรวจพบได้ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ โดยส่วนใหญ่เกิดจากความแตกต่างระหว่างดัชนีการหักเหของแสงของแบคทีเรียและสภาพแวดล้อมโดยรอบ แบคทีเรียที่มีแฟลเจลลาเคลื่อนไหวอย่างแรง ในขณะที่แบคทีเรียที่ไม่มีแฟลเจลลาแสดงการเคลื่อนที่แบบบราวเนียนผิดปกติ แบคทีเรียที่มีชีวิต เช่น Treponema pallidum, Leptospira และ Campylobacter มีรูปร่างและรูปแบบการเคลื่อนไหวที่โดดเด่น ซึ่งมีความสำคัญในการวินิจฉัย วิธีการที่ใช้กันทั่วไป ได้แก่ วิธีลดแรงดัน วิธีหยดจี้ และวิธีการฝอย
1. ทาวาสลีนรอบๆ รูเว้าของกระจกเว้าที่สะอาด โดยวิธีห้อยหยด ใช้ห่วงฉีดวัคซีนเพื่อนำวงแหวนสารแขวนลอยแบคทีเรียมาวางไว้ตรงกลางกระจกครอบ จากนั้นจัดแนวรูเว้าของกระจกเว้าให้ตรงกับ วางลงบนกึ่งกลางของฝาครอบกระจกแล้วปิดฝาไว้ จากนั้นพลิกกลับอย่างรวดเร็ว กดกระจกฝาครอบเบาๆ เพื่อให้ติดแน่นกับวาสลีนตรงขอบรูเว้า แล้วสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์กำลังขยายสูง (หรือ สนามมืด)
2. นำวงแหวนสารแขวนลอยของแบคทีเรียที่มีห่วงใส่เชื้อมาวางไว้ตรงกลางสไลด์แก้วที่สะอาดโดยวิธีลดแรงดัน และค่อยๆ คลุมสารแขวนลอยของแบคทีเรียด้วยกระจกคลุม ระวังอย่าให้เกิดฟองและการล้นของสารแขวนลอยของแบคทีเรีย . หลังจากยืนนิ่งสักครู่ ให้สังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์กำลังสูงในสนามที่สว่าง (หรือสนามมืด)
3. วิธีเส้นเลือดฝอยส่วนใหญ่จะใช้สำหรับการตรวจสอบจลนพลศาสตร์ของแบคทีเรียแบบไม่ใช้ออกซิเจน โดยปกติจะเลือกความยาว 60~70 มม. หลังจากดูดแบคทีเรียไร้อากาศที่แขวนลอยผ่านเส้นเลือดฝอยที่มีรูรับแสง 0.5-1.0 มม. แล้ว ให้ปิดปลายทั้งสองด้านของเส้นเลือดฝอยด้วยเปลวไฟ เส้นเลือดฝอยได้รับการแก้ไขบนสไลด์แก้วด้วยกระดาษพลาสติก และสังเกตภายใต้เลนส์กำลังสูงในสนามมืด
การสังเกตตัวอย่างจุลินทรีย์ที่เปื้อนด้วยกล้องจุลทรรศน์:
หลังจากที่ตัวอย่างแบคทีเรียถูกย้อม เนื่องจากสีที่ตัดกันอย่างมากระหว่างแบคทีเรียกับสภาพแวดล้อมโดยรอบ ลักษณะทางสัณฐานวิทยาของแบคทีเรีย (เช่น ขนาด รูปร่าง การจัดเรียง ฯลฯ ) ของแบคทีเรียและโครงสร้างพิเศษบางอย่าง (เช่น เช่น แคปซูล แฟลเจลลา สปอร์ ฯลฯ) สามารถสังเกตได้อย่างชัดเจนด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงธรรมดา และสามารถจำแนกและจำแนกแบคทีเรียตามปฏิกิริยาการย้อมสีได้
(1) ขั้นตอนทั่วไปของการย้อมด้วยแบคทีเรีย ขั้นตอนทั่วไปของการย้อมด้วยแบคทีเรียคือ: สเมียร์ (การทำให้แห้ง)—การตรึง—การย้อมสี
1. สเมียร์ การเตรียมเลือด สารคัดหลั่ง สิ่งขับถ่าย การเจาะของเหลวและการเพาะเลี้ยงของเหลว และรอยเปื้อนฟิล์มบางโดยตรงบนสไลด์แก้ว การชันสูตรพลิกศพหรือเนื้อเยื่อของสัตว์ที่ติดเชื้อ ทารอยโรคด้วยสำลีพันก้านเพื่อสุ่มตัวอย่าง สำหรับการเตรียมโคโลนีของแบคทีเรียหรือสนามหญ้าบนอาหารแข็ง ขั้นแรกให้ใช้ห่วงสำหรับปลูกเชื้อเพื่อนำวงแหวนที่มีน้ำเกลือปกติมาวางไว้ตรงกลางสไลด์แก้ว จากนั้นใช้ลูปสำหรับการปลูกเชื้อแบบปลอดเชื้อเพื่อเพาะและบดจำนวนเล็กน้อย โดยให้เท่าๆ กันในน้ำเกลือปกติ เกลี่ยให้ทั่วพื้นผิวเคลือบขนาด 1 ตร.ซม. แล้วปล่อยให้แห้งตามธรรมชาติที่อุณหภูมิห้องหรือค่อยๆ แห้งโดยเว้นระยะห่าง
2. วัตถุประสงค์ของการตรึงคือการฆ่าเชื้อแบคทีเรีย จับโปรตีนและโครงสร้างของแบคทีเรียให้แข็งตัว และอำนวยความสะดวกในการย้อมสี ส่งเสริมให้แบคทีเรียเกาะติดกับสไลด์เพื่อหลีกเลี่ยงการถูกน้ำชะล้างออกไประหว่างการซัก เปลี่ยนการซึมผ่านของแบคทีเรียเป็นสีย้อมซึ่งเป็นประโยชน์ต่อการย้อมสีโครงสร้างภายในเซลล์ของแบคทีเรีย โดยปกติจะได้รับการแก้ไขโดยการให้ความร้อนด้วยเปลวไฟ และสเมียร์แห้งจะถูกส่งผ่านเปลวไฟอย่างรวดเร็วเป็นเวลา 3 ครั้ง เป็นการดีกว่าที่จะไม่ทำให้ผิวหนังบริเวณหลังมือไหม้เมื่อสัมผัสกับสไลด์
3. การย้อมสี ตามวัตถุประสงค์ในการตรวจสอบที่แตกต่างกัน ให้เลือกวิธีการย้อมที่แตกต่างกันสำหรับการย้อม เมื่อทำการย้อม ให้เติมสารละลายสีย้อมลงไปทีละหยดเพื่อเพิ่มความครอบคลุม
4. Mordant สารใดๆ ที่สามารถเพิ่มความสัมพันธ์ระหว่างสีย้อมกับวัตถุที่ย้อม ตรึงสีย้อมบนวัตถุที่ย้อม และทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในการซึมผ่านของเยื่อหุ้มเซลล์ เรียกว่า mordant ที่ใช้กันทั่วไป ได้แก่ สารส้ม กรดแทนนิก เกลือของโลหะ และไอโอดีน ฯลฯ และยังใช้การให้ความร้อนเพื่อเพิ่มสีสันอีกด้วย สารช่วยยึดเกาะสามารถใช้ได้ระหว่างการย้อมสีปฐมภูมิและการย้อมสีรองพื้น และยังสามารถใช้ได้หลังการตรึงหรือบรรจุในสารยึดเกาะและการย้อมสีอีกด้วย
5. การลดสี สารเคมีใดๆ ที่สามารถขจัดสีของวัตถุที่ย้อมได้เรียกว่าเครื่องกำจัดสี เอทานอล อะซิโตน ฯลฯ มักใช้เป็นสารกำจัดสี สารกำจัดสีสามารถตรวจจับระดับความคงตัวของการผสมระหว่างแบคทีเรียและสีย้อม ซึ่งสามารถนำไปใช้สำหรับการย้อมสีที่แตกต่างกันได้
6. สารยับยั้งแบคทีเรียหรือโครงสร้างที่ถูกกำจัดสีออกมักจะถูกย้อมด้วยน้ำยาขจัดคราบเพื่อให้สังเกตได้ง่าย สีของสารละลายสีย้อมจะแตกต่างจากสีของสารละลายสีย้อมหลักเพื่อให้เกิดความแตกต่างที่ชัดเจน สีย้อมไม่ควรเข้มเกินไปเพื่อไม่ให้ปกปิดสีของสีย้อมเริ่มแรก
