ความรู้เบื้องต้นเกี่ยวกับกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง
เครื่องมือหรืออุปกรณ์ที่ขยายวัตถุขนาดเล็กหรือส่วนเล็กๆ ของวัตถุด้วยกำลังขยายสูงเพื่อการสังเกต มีการใช้กันอย่างแพร่หลายในอุตสาหกรรมและการผลิตทางการเกษตรและการวิจัยทางวิทยาศาสตร์ นักชีววิทยาและบุคลากรทางการแพทย์ยังใช้กล้องจุลทรรศน์เป็นจำนวนมากในธุรกิจของพวกเขา แบ่งออกเป็นกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงและกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน
กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงเป็นกล้องจุลทรรศน์ที่ใช้แสงที่ตามองเห็นเป็นแหล่งกำเนิดแสง กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงธรรมดาสามารถแบ่งออกเป็นสองส่วน: ระบบแสงและอุปกรณ์เชิงกล ระบบออปติกส่วนใหญ่ประกอบด้วยเลนส์ใกล้ตา เลนส์ใกล้วัตถุ คอนเดนเซอร์ ไดอะแฟรม และแหล่งกำเนิดแสง อุปกรณ์กลไกส่วนใหญ่ประกอบด้วยกระบอกเลนส์ เสากระจก เวที ฐานกระจก สกรูปรับความหนา และส่วนอื่นๆ (รูปที่ 1) หลักการพื้นฐานทางแสงแสดงไว้ในรูปที่ 2 เลนส์นูนเล็กๆ ทางด้านซ้ายในรูปแสดงถึงกลุ่มเลนส์ที่มีทางยาวโฟกัสสั้น เรียกว่า เลนส์ใกล้วัตถุ เลนส์นูนขนาดใหญ่ทางด้านขวาแสดงถึงกลุ่มเลนส์ที่มีทางยาวโฟกัสยาว ซึ่งเรียกว่าเลนส์ใกล้ตา วัตถุที่จะสังเกต (AB) จะอยู่นอกจุดโฟกัส (f1) ของเลนส์ใกล้วัตถุเล็กน้อย แสงจากวัตถุสร้างภาพจริงที่ขยายกลับด้าน (B'A') เล็กน้อยภายในโฟกัสของเลนส์ใกล้ตา (f2) หลังจากผ่านเลนส์ใกล้วัตถุ ดวงตาของผู้สังเกตจะขยายภาพจริง (B'A') ให้เป็นภาพเสมือนกลับหัว (B"A") ผ่านช่องมองภาพ
เลนส์ใกล้ตาอยู่เหนือกระบอกกล้องจุลทรรศน์และโดยทั่วไปประกอบด้วยเลนส์นูนสองเลนส์ นอกจากจะขยายภาพจริงที่เกิดจากเลนส์ใกล้วัตถุแล้ว ยังจำกัดขอบเขตการมองเห็นที่ตามองเห็นอีกด้วย ตามการขยาย มีเลนส์ตาที่ใช้กันทั่วไปสามประเภท: 5 เท่า 10 เท่า และ 15 เท่า
เลนส์ใกล้วัตถุโดยทั่วไปจะอยู่ใต้กระบอกกล้องจุลทรรศน์ ใกล้กับวัตถุที่กำลังสังเกต ประกอบด้วยเลนส์ 8 ถึง 10 ชิ้น หน้าที่ของมันคือการขยาย (สร้างภาพจริงที่ขยายใหญ่ขึ้นสำหรับวัตถุ) อย่างที่สองคือรับรองคุณภาพของภาพ และอย่างที่สามคือเพิ่มความละเอียด เลนส์ใกล้วัตถุที่ใช้กันทั่วไปสามารถแบ่งออกเป็นกำลังขยายต่ำ (4x) กำลังขยายปานกลาง (10x หรือ 20x) กำลังขยายสูง (40x) และเลนส์ใกล้วัตถุแบบจุ่มน้ำมัน (100x) ตามกำลังขยาย เลนส์ใกล้วัตถุหลายตัวติดตั้งอยู่บนล้อเปลี่ยนกระจก และสามารถเลือกเลนส์ใกล้วัตถุที่มีหลายเลนส์แตกต่างกันได้โดยหมุนจานหมุนตามต้องการ
กำลังขยายของกล้องจุลทรรศน์คือผลคูณของเลนส์ใกล้ตาคูณด้วยวัตถุประสงค์ ตัวอย่างเช่น หากเลนส์ใกล้ตาเป็น 10 เท่า และเลนส์ใกล้วัตถุเป็น 40 เท่า กำลังขยายจะเป็น 40×10 เท่า (กำลังขยาย 400 เท่า) กล้องจุลทรรศน์ที่ดีสามารถขยายได้ 2,000 เท่า และสามารถแยกแยะจุดสองจุดที่ห่างกัน 1×10-5 ซม.
เมื่อแสงสีขาวผ่านเลนส์นูน แสงที่มีความยาวคลื่นสั้นกว่า (สีน้ำเงิน-ม่วง) จะมีการหักเหแสงมากกว่าแสงที่มีความยาวคลื่นยาว (สีแดง-ส้ม) ดังนั้นเมื่อถ่ายภาพจึงมีสเปกตรัมต่างๆ รอบภาพ และมีวงกลมของแสงสีน้ำเงินหรือสีแดง ข้อบกพร่องของสีนี้เรียกว่าความคลาดเคลื่อนของสี เนื่องจากมุมต่างๆ ที่แสงเข้า (และออก) ในส่วนต่างๆ ของผิวเลนส์ แสงที่ผ่านขอบเลนส์จะหักเหเป็นมุมที่กว้างกว่าแสงที่ผ่านจุดศูนย์กลางของเลนส์ ดังนั้น ภาพเบลอและบิดเบี้ยวจึงปรากฏขึ้นรอบๆ ภาพระหว่างการถ่ายภาพ ข้อบกพร่องของความโค้งของพื้นผิวการถ่ายภาพนี้เรียกว่าความคลาดทรงกลม ชุดเลนส์นูนและเลนส์เว้าที่มีรูปร่าง โครงสร้าง และระยะต่างกันจะทำงานร่วมกันเพื่อแก้ไขความคลาดเคลื่อนสีและความคลาดเคลื่อนทรงกลมให้ได้มากที่สุด เกิดเป็นภาพที่สว่าง ชัดเจน และแม่นยำ ด้วยเหตุนี้เลนส์ใกล้ตาหรือเลนส์ใกล้วัตถุจึงประกอบด้วยชุดเลนส์ตามลำดับ เลนส์ดังกล่าวเรียกว่า plan achromats
เมื่อแสงฉายจากตัวกลางหนึ่ง (เช่น อากาศ) ไปยังตัวกลางที่มีความหนาแน่นสูงอีกตัว (เช่น แก้ว) แสงจะโค้งไปที่ "เส้นปกติ" (เส้นที่ตั้งฉากกับส่วนต่อประสานของตัวกลาง) เช่น เส้น BOA ในรูป 3. เมื่อแสงผ่านจากตัวกลางที่มีความหนาแน่นสูง (แก้ว) ไปยังตัวกลางที่ไม่หนาแน่น (อากาศ) แสงจะเบี่ยงเบนไปจาก "เส้นปกติ" เช่น เส้น AOB (รูปที่ 3a) เมื่อแสงผ่านกระจกคอนเดนเซอร์ (ดัชนีการหักเหของแสง 1.51) และเข้าสู่อากาศ แสงจะเบี่ยงเบนและหักเหออกไปด้านนอกด้วย ดังนั้นปริมาณแสงที่เข้าสู่เลนส์ใกล้วัตถุจึงลดลงอย่างมาก และความละเอียดของภาพก็จะลดลงด้วย เมื่อใช้เลนส์ใกล้วัตถุ 100x หากเติมน้ำมันระหว่างเลนส์ใกล้วัตถุและกระจกครอบ (ดัชนีการหักเหของแสงคือ 1.51 เช่นกัน) เพื่อแยกอากาศ แสงสามารถเข้าสู่เลนส์ใกล้วัตถุได้โดยแทบไม่มีการหักเห ซึ่งจะเพิ่มความสว่างและความละเอียดของเลนส์ใกล้วัตถุ รูปภาพ . วัตถุประสงค์ดังกล่าวเรียกว่าวัตถุประสงค์ในการแช่น้ำมัน (รูปที่ 3b)
คอนเดนเซอร์ตั้งอยู่ใต้ระยะกล้องจุลทรรศน์ ซึ่งสามารถรวมแสงจากแหล่งกำเนิดแสง รวมแสงไปที่ชิ้นงานทดสอบ และทำให้ชิ้นงานได้รับการฉายรังสีอย่างสม่ำเสมอด้วยความเข้มแสงปานกลาง ปลายด้านล่างของคอนเดนเซอร์ติดตั้งตัวหยุดรูรับแสง (ไดอะแฟรม) เพื่อควบคุมความหนาของลำแสง
แหล่งกำเนิดแสงของกล้องจุลทรรศน์แบบออปติคัลธรรมดาจะอยู่ใต้คอนเดนเซอร์ ซึ่งเป็นหลอดไฟที่มีความเข้มเป็นพิเศษพร้อมการส่องสว่างที่สม่ำเสมอ และติดตั้งตัวต้านทานแบบปรับค่าได้เพื่อเปลี่ยนความเข้มของแสง
เนื่องจากแสงจากแหล่งกำเนิดแสงของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงธรรมดาส่งผ่านจากด้านล่างของตัวเลนส์ ผ่านเลนส์คอนเดนเซอร์ เลนส์ใกล้วัตถุ และมาถึงเลนส์ตา ตัวอย่างที่จะสังเกตได้จึงต้องตัดเป็นชิ้นบาง ๆ ที่มีความหนาประมาณ 6 μm ที่สามารถส่งผ่านแสงในการวิจัยทางการแพทย์และชีวภาพ และย้อมสีเพื่อแสดงเนื้อเยื่อและเซลล์ต่าง ๆ และโครงสร้างละเอียดอื่น ๆ กระบวนการแปรรูปทั้งหมดเรียกว่าเทคนิคการหั่นเนื้อเยื่อแบบดั้งเดิม ซึ่งรวมถึงการเลือกวัสดุเนื้อเยื่อที่เหมาะสม การตรึงด้วยสารละลายฟอร์มาลดีไฮด์ (ฟอร์มาลิน) การขจัดน้ำด้วยแอลกอฮอล์ทีละขั้นตอน การฝังในพาราฟิน การตัดเนื้อเยื่อเป็นชิ้นบาง ๆ ด้วยไมโครโทม และติดตั้ง บนกระจกสไลด์ และหลังจากย้อมด้วยสีย้อมฮีมาทอกซีลิน-อีโอซิน ในที่สุด สไลด์เนื้อเยื่อก็ถูกติดด้วยกาวเรซินแบบออปติก สไลด์ทิชชู่ที่เตรียมไว้สามารถเก็บไว้ได้นาน
เลนส์ใกล้ตาและเลนส์ใกล้วัตถุของกล้องจุลทรรศน์ติดตั้งอยู่ที่ปลายทั้งสองด้านของกระบอกเลนส์ และระยะห่างคงที่ วางสไลด์ทิชชู่ไว้บนเวที แล้วหมุนสกรูปรับหยาบเพื่อให้เวทีเข้าใกล้เลนส์ใกล้วัตถุ ชิ้นเนื้อเยื่อเข้าสู่ระนาบโฟกัสของเลนส์ใกล้วัตถุ และสามารถมองเห็นภาพเนื้อเยื่อในชิ้นงานทดสอบได้ในเลนส์ใกล้ตา จากนั้นใช้สกรูปรับละเอียดเพื่อทำให้ภาพในช่องมองภาพชัดเจนจนสังเกตได้ เมื่อเปลี่ยนกำลังขยาย ต้องเปลี่ยนเลนส์ใกล้ตาหรือเลนส์ใกล้วัตถุ
