คุณสมบัติและการใช้งานกล้องจุลทรรศน์เลเซอร์คอนโฟคอล
ในขณะที่ใช้กล้องจุลทรรศน์ปกติ ระนาบภาพของการสังเกตจะถูกแยกออกจากระนาบแนวแกนที่อยู่ใกล้เคียงโดยการซ้อนทับระนาบโฟกัสของเลนส์ใกล้วัตถุกับตัวตรวจจับ ในกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล การแยกนี้สามารถเกิดขึ้นได้โดยการส่องสว่างตัวอย่างด้วยจุดที่จำกัดการเลี้ยวเบนของ แสงและการกรองแสงเล็ดลอดโดยใช้รูเข็มในเส้นทางของแสงที่รวบรวมไว้ที่จุดโฟกัสคอนจูเกตของจุดแสงนี้เพื่อให้เกิดการแยกตัวและปรับปรุงความละเอียด
มีเพียงแสงที่สะท้อนกลับจากชั้นตัวอย่างแบบคอนจูเกตเท่านั้นที่สามารถผ่านรูเข็มในเส้นทางแสงสะสมได้ ในขณะที่การสะท้อนกลับของชั้นตัวอย่างที่ไม่เกี่ยวข้องที่เหลือจะถูกปิดกั้นโดยรูเข็ม สิ่งนี้ทำให้ความละเอียดเพิ่มขึ้นอย่างมาก ด้านล่างนี้เป็นการเปรียบเทียบระหว่างกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์หลายมิติและกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลของตัวอย่างที่มีความหนาเท่ากัน เมื่อถ่ายภาพชุดหนึ่งโดยใช้ระนาบโฟกัสที่ต่างกัน รูปภาพที่เรียกกันทั่วไปว่า "z-stack" จะถูกสร้างขึ้น ซึ่งจะแสดงความละเอียดและคอนทราสต์ที่เพิ่มขึ้นจากกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล และเหตุผลเบื้องหลังของการเพิ่มเหล่านี้ จะเห็นได้ว่าการตรวจสอบภาพที่ด้านบนของปึกซึ่งมีระนาบภาพอยู่เหนือเนื้อเยื่อจะเผยให้เห็นแสงที่กระจัดกระจายจำนวนมากในภาพเรืองแสง ในขณะที่ภาพกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลจะปรากฏเป็นสีดำ การลดลงของ PSF ในทิศทางตามแนวแกนนี้ส่งผลโดยตรงต่อความแตกต่างในความละเอียดที่สังเกตได้ที่อินเทอร์เฟซแบบออปติคัลที่อยู่ตรงกลางของ z-stack
การถ่ายภาพด้วยการสแกนชิ้นแสง
คุณสมบัติอีกประการหนึ่งของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบสแกนด้วยเลเซอร์ก็คือเป็นเทคนิคการสแกนภาพ เทคนิคการส่องสว่างแบบมุมกว้างแบบดั้งเดิมจะให้แสงสว่างแก่ตัวอย่างทั้งหมด เพื่อให้สามารถจับภาพได้โดยตรงด้วยตาเปล่าหรือเครื่องตรวจจับ แต่ LSCM จะใช้ลำแสงโฟกัสหนึ่งลำหรือมากกว่าเพื่อสแกนผ่านตัวอย่าง เพื่อให้ภาพที่ได้เรียกว่า ชิ้นแสง ดังแสดงในแผนภาพต่อไปนี้ ความแตกต่างระหว่างการส่องสว่างสนามกว้างแบบดั้งเดิมและการส่องสว่างแบบคอนโฟคอลการสแกนด้วยเลเซอร์มีดังต่อไปนี้
ดังนั้นวิธีการปฏิบัติของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลสมัยใหม่จึงแสดงไว้ในภาพด้านล่าง แสงกระตุ้นจากเลเซอร์จะถูกส่งผ่านกระจกไดโครอิก และสแกนผ่านกระจกกัลวาโนมิเตอร์คู่หนึ่งในทิศทาง x และทิศทาง y ของตัวอย่าง และการกระตุ้น (หรือการสะท้อน) ของตัวอย่างจะผ่านรูเข็มเข้าไปใน PMT เครื่องตรวจจับที่จะบันทึกและภาพที่สแกนที่บันทึกไว้จะถูกสร้างขึ้นใหม่โดยคอมพิวเตอร์เพื่อสร้างภาพที่แท้จริงของตัวอย่าง
