กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์คอนโฟคอล - คุณสมบัติและการใช้งาน
กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบสแกนด้วยเลเซอร์ (LSCM) เป็นกล้องจุลทรรศน์ประเภทหนึ่งที่ออกแบบโดยใช้เทคโนโลยีคอนจูเกตโฟกัส กล่าวคือ แหล่งกำเนิดแสงเลเซอร์ ตัวอย่างที่จะวัด และเครื่องตรวจจับล้วนอยู่ในตำแหน่งคอนจูเกตซึ่งกันและกัน
พื้นฐาน
ในกล้องจุลทรรศน์ทั่วไป ระนาบภาพของการสังเกตจะถูกแยกออกจากระนาบแนวแกนที่อยู่ติดกันโดยการวางระนาบโฟกัสของเลนส์ใกล้วัตถุให้ตรงกันกับตัวตรวจจับ ในขณะที่ในกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลนั้น จุดไฟที่จำกัดการเลี้ยวเบนจะถูกนำมาใช้เพื่อให้แสงสว่างแก่ตัวอย่างและ A รูเข็มถูกใช้ในเส้นทางแสงที่รวบรวมไว้ที่โฟกัสคอนจูเกตของจุดแสงเพื่อกรองแสงเล็ดลอดเพื่อสร้างเอฟเฟกต์การแยกนี้และปรับปรุงความละเอียด
คุณสมบัติการถ่ายภาพ
การถ่ายภาพด้วยการสแกนส่วนแสง
คุณสมบัติอีกประการหนึ่งของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบสแกนด้วยเลเซอร์ก็คือเป็นเทคโนโลยีการสแกนภาพ เทคโนโลยีการส่องสว่างแบบมุมกว้างแบบดั้งเดิมจะให้แสงสว่างแก่ตัวอย่างทั้งหมด ดังนั้นจึงสามารถจับภาพได้โดยตรงด้วยตาเปล่าหรือเครื่องตรวจจับ แต่ LSCM จะใช้ลำแสงหรือลำแสงโฟกัสหลายลำที่ส่องผ่านตัวอย่างเพื่อสแกนและถ่ายภาพ ภาพที่ได้เรียกว่าส่วนแสง ข้อมูลต่อไปนี้แสดงความแตกต่างระหว่างวิธีการส่องสว่างแบบสนามกว้างแบบดั้งเดิมและวิธีการส่องสว่างแบบคอนโฟคอลด้วยการสแกนด้วยเลเซอร์
ดังนั้นวิธีการทำงานจริงของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลสมัยใหม่จึงมีดังแสดงในรูปด้านล่าง แสงกระตุ้นที่ปล่อยออกมาจากเลเซอร์จะส่องผ่านกระจกไดโครอิก และจะถูกสแกนในทิศทาง x และทิศทาง y ของตัวอย่างผ่านกัลวาโนมิเตอร์คู่หนึ่ง การกระตุ้น (หรือการสะท้อน) ของตัวอย่างคือ แสงเข้าสู่เครื่องตรวจจับ PMT ผ่านรูเข็มและถูกบันทึกไว้ และภาพที่สแกนที่บันทึกไว้จะถูกสร้างขึ้นใหม่โดยคอมพิวเตอร์เพื่อสร้างภาพตัวอย่างจริงขึ้นมาใหม่
สร้างภาพ "z-stack" บนระนาบโฟกัสที่แตกต่างกัน
มีเพียงแสงที่สะท้อนกลับจากชั้นตัวอย่างที่เชื่อมต่อกันเท่านั้นที่สามารถผ่านรูเล็กๆ ในเส้นทางแสงของคอลเลกชันได้ และการสะท้อนของชั้นตัวอย่างที่ไม่เกี่ยวข้องที่เหลือจะถูกปิดกั้นโดยรูเล็กๆ ซึ่งอาจส่งผลให้มีการปรับปรุงความละเอียดอย่างมีนัยสำคัญ การเปรียบเทียบแบบเทียบเคียงระหว่างกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์หลายมิติและกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลของตัวอย่างที่มีความหนาเท่ากัน เมื่อถ่ายภาพชุดหนึ่งที่ระนาบโฟกัสต่างกัน ภาพที่เรียกกันทั่วไปว่า "z-stacks" จะถูกสร้างขึ้นได้ ซึ่งแสดงให้เห็นถึงความละเอียดและคอนทราสต์ที่เพิ่มขึ้นจากกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลและสาเหตุที่แท้จริงของการได้รับเหล่านี้ จะเห็นได้ว่าการตรวจสอบภาพที่ด้านบนของปึกด้วยระนาบภาพเหนือเนื้อเยื่อจะเผยให้เห็นแสงที่กระจัดกระจายจำนวนมากในภาพเรืองแสง ในขณะที่ภาพกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลจะปรากฏเป็นสีดำ การลดลงของ PSF ในแนวแกนนี้ส่งผลโดยตรงต่อความแตกต่างของความละเอียดที่สังเกตได้ที่อินเทอร์เฟซแบบออปติคอลที่อยู่ตรงกลางของ z-stack
ความละเอียดได้รับการปรับปรุงอย่างมากเมื่อเทียบกับแสงมุมกว้าง
ในกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ ความเข้มของแสงที่ปล่อยออกมาจากจุดเดียวอธิบายโดยฟังก์ชันการกระจายจุด (PSF) และรูปแบบของมันคือดิสก์โปร่ง ความละเอียดของระบบเรืองแสงสามารถอธิบายได้ด้วยรัศมีของดิสก์ Airy ซึ่งสามารถอธิบายได้ด้วยรูรับแสงตัวเลขของเลนส์ใกล้วัตถุและความยาวคลื่นของแสงกระตุ้นจะกำหนด
