ห้องเรียนการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์丨การประยุกต์ใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบสะท้อนแสงภายในทั้งหมด (TIRFM) เป็นเทคนิคที่ใช้คลื่นอีวาเซนเซนต์ที่เกิดจากลำแสงที่แพร่กระจายระหว่างตัวกลางที่มีดัชนีการหักเหของแสงที่แตกต่างกันสองตัวเพื่อตรวจสอบพื้นผิวของเซลล์ที่มีชีวิตที่ติดฉลากเรืองแสง ในทางปฏิบัติ เมื่อลำแสงเลเซอร์ที่ตกกระทบสัมผัสกับส่วนต่อประสานระหว่างใบปิดและตัวกลางที่เป็นน้ำซึ่งมีเซลล์อยู่ ลำแสงจะสะท้อนที่มุมวิกฤต (การสะท้อนกลับภายในทั้งหมด) เนื่องจากพลังงานของคลื่นที่หายไปจะลดลงอย่างทวีคูณตามระยะห่างจากใบปิด มีเพียงฟลูออโรฟอร์ที่อยู่ภายในระยะ 10 นาโนเมตรของพื้นผิว (ระหว่าง 10 ถึง 200 นาโนเมตร) เท่านั้นที่ตื่นเต้นกับคลื่นที่หายไป ในขณะที่ฟลูออโรฟอร์ที่อยู่ห่างออกไปจะไม่ได้รับการกระตุ้นเป็นส่วนใหญ่ ได้รับผลกระทบ ดังนั้น TIRFM จึงส่งผลให้มีระดับสัญญาณสูงจากฟลูออโรฟอร์ที่อยู่ใกล้กับใบปิดซึ่งซ้อนทับบนพื้นหลังที่มืดมาก ทำให้มีอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนที่ดีเยี่ยม ข้อจำกัดอย่างมากของความลึกในการกระตุ้นเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการศึกษาโมเลกุลเดี่ยวหรือองค์ประกอบของเยื่อหุ้มเซลล์และออร์แกเนลล์ในเซลล์ที่ยึดเกาะใกล้กับพื้นผิวใบปิด (ดูรูปที่ 8(e)) เนื่องจากการกระตุ้นถูกจำกัดไว้ในบริเวณบางๆ ใกล้กับใบปิด การฟอกสีด้วยแสงและความเป็นพิษต่อแสงจึงถูกจำกัดไว้ในบริเวณเหล่านี้ด้วย ทำให้ TIRFM เป็นหนึ่งในวิธีการที่มีประโยชน์มากที่สุดสำหรับการสังเกตระยะยาว เทคนิคนี้ได้กลายเป็นเครื่องมือพื้นฐานสำหรับการศึกษาปรากฏการณ์ที่หลากหลายในเซลล์และอณูชีววิทยา
Deconvolution เป็นอัลกอริทึมที่ใช้กับชุดของภาพโฟกัสทั้งหมดที่ได้มาตามแกนออปติคอล (Z) เพื่อปรับปรุงสัญญาณโฟตอนในกองภาพสำหรับระนาบภาพที่กำหนดหรือระนาบโฟกัสหลายระนาบ กล้องจุลทรรศน์ต้องติดตั้งไดรฟ์โฟกัสแบบใช้มอเตอร์ที่มีความแม่นยำสูงเพื่อรับประกันการได้ภาพในช่วงเวลาที่กำหนดอย่างแม่นยำระหว่างระนาบโฟกัสของตัวอย่าง ในการใช้งานทั่วไป (ดูรูปที่ 8(f)) กระบวนการ deconvolution จะใช้เพื่อลดความพร่ามัวและขจัดแสงที่ไม่อยู่ในโฟกัสออกจากระนาบโฟกัสที่กำหนดโดยใช้การกระตุ้นและการปล่อยสารเรืองแสงไวด์ฟิลด์ แอปพลิเคชั่นที่ซับซ้อนที่สุดคือการใช้กระบวนการแยกส่วนกับกองภาพทั้งหมดเพื่อสร้างมุมมองที่ฉายหรือแบบจำลอง 3 มิติ ชุดภาพไวด์ฟิลด์ที่ใช้สำหรับการแยกส่วนจะจับภาพจำนวนโฟตอนสูงสุดตามทฤษฎีที่ปล่อยออกมาจากตัวอย่าง กระบวนการแยกส่วนจะกระจายความเข้มของโฟตอนที่ "เบลอ" ที่ปล่อยออกมาด้านบนและด้านล่างของระนาบโฟกัสกลับไปยังระนาบเดิม ดังนั้น การแยกคอนโวลูชั่นจึงใช้ความเข้มของการปล่อยเกือบทั้งหมดที่มีอยู่และให้งบประมาณที่เบาที่สุด ทำให้เทคนิคนี้เป็นทางเลือกสำหรับตัวอย่างที่ไวต่อแสงมาก
ตัวแปรของปรากฏการณ์การถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์บนกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ ฟลูออเรสเซนซ์หรือการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์ Förster (FRET) ถูกนำมาใช้เพื่อรับข้อมูลทางโลกและเชิงพื้นที่เชิงปริมาณเกี่ยวกับการจับและปฏิสัมพันธ์ของโปรตีน ไขมัน เอนไซม์ และกรดนิวคลีอิกในเซลล์ที่มีชีวิต FRET สามารถใช้ได้ทั้งเทคนิคแบบสถานะคงที่หรือแบบแก้ไขตามเวลา แต่การถ่ายภาพ FRET แบบแก้ไขเวลามีข้อได้เปรียบในการทำแผนที่ระยะห่างระหว่างผู้บริจาคและผู้รับที่แม่นยำกว่า กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบไวด์ฟิลด์มาตรฐานที่ติดตั้งตัวกรองการกระตุ้นและการปล่อยที่เหมาะสม และกล้องที่ละเอียดอ่อนสามารถใช้สำหรับการถ่ายภาพ FRET ไบโอเซนเซอร์ที่ประกบโปรตีนหรือเปปไทด์ที่ไวต่อสิ่งแวดล้อมระหว่างโปรตีนเรืองแสงที่ใช้กับ FRET สองตัวได้ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในชีววิทยาของเซลล์ โพรบเหล่านี้สามารถถ่ายภาพได้อย่างง่ายดายภายใต้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบไวด์ฟิลด์โดยใช้เทคนิค FRET ที่ปล่อยไวแสงรวมกับการวิเคราะห์แบบอัตราส่วน นอกจากนี้ การถ่ายภาพสเปกตรัมและการผสมเชิงเส้นโดยใช้เลเซอร์สแกนคอนโฟคอลไมโครสโคปสามารถช่วยตรวจสอบปรากฏการณ์ FRET ในไบโอเซนเซอร์และการประยุกต์ใช้โปรตีนเรืองแสงอื่นๆ
กล้องจุลทรรศน์การถ่ายภาพตลอดอายุการใช้งานของฟลูออเรสเซนซ์ (FLIM) เป็นเทคนิคขั้นสูงที่สามารถบันทึกอายุการใช้งานของฟลูออเรสเซนซ์และตำแหน่งเชิงพื้นที่ของฟลูออโรฟอร์ในทุกตำแหน่งในภาพได้พร้อมๆ กัน วิธีนี้มีกลไกในการศึกษาพารามิเตอร์ทางสิ่งแวดล้อม เช่น ค่า pH ความเข้มข้นของไอออนิก ขั้วของตัวทำละลาย ปฏิกิริยาระหว่างกันแบบไม่มีโควาเลนต์ ความหนืด และความตึงของออกซิเจนในเซลล์ที่มีชีวิตเดียว และแสดงข้อมูลในอาร์เรย์เชิงพื้นที่และเชิงเวลา การวัด FLIM ของอายุการใช้งานของสถานะตื่นเต้นในระดับนาโนวินาทีนั้นไม่ขึ้นกับความเข้มข้นของฟลูออโรฟอร์ในท้องถิ่น เอฟเฟกต์การฟอกสีด้วยแสง และความยาวเส้นทาง (ความหนาของตัวอย่าง) แต่จะไวต่อปฏิกิริยาของสถานะตื่นเต้น เช่น การถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์ ในความเป็นจริง การรวม FLIM กับ FRET โดยการตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงตลอดอายุของผู้บริจาคฟลูออเรสเซนต์ก่อนและหลังการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์ถือเป็นวิธีที่ดีที่สุดในการศึกษาปรากฏการณ์นี้
การเคลื่อนที่ (ค่าสัมประสิทธิ์การแพร่กระจายตามขวาง) ของโมเลกุลขนาดใหญ่ที่มีฉลากเรืองแสงและฟลูออโรฟอร์ขนาดเล็กสามารถกำหนดได้โดยการนำฟลูออเรสเซนซ์กลับมาใช้ใหม่หลังจากเทคนิคการฟอกสีด้วยแสง (FRAP) ใน FRAP พื้นที่ที่เลือกขนาดเล็กมาก (เส้นผ่านศูนย์กลางไม่กี่ไมโครเมตร) จะได้รับแสงอย่างเข้มข้น โดยปกติจะใช้เลเซอร์ เพื่อสร้างการฟอกสีฟลูออโรฟอร์ในบริเวณนั้นอย่างสมบูรณ์ ผลที่ได้คือการลดหรือการทำลายล้างของสารเรืองแสงอย่างมาก อัตราและขอบเขตของการกู้คืนความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์ในบริเวณที่ฟอกขาวได้รับการตรวจสอบตามฟังก์ชันของเวลาที่ความเข้มของการกระตุ้นต่ำเพื่อสร้างข้อมูลเกี่ยวกับจลนพลศาสตร์ของการเพิ่มจำนวนฟลูออโรฟอร์และการกู้คืน (รูปที่ 9) FRAP มักดำเนินการโดยใช้ EGFP หรือโปรตีนเรืองแสงอื่นๆ เทคนิคการกระตุ้นด้วยแสงที่เกี่ยวข้องนั้นขึ้นอยู่กับฟลูออโรฟอร์ในกรงสังเคราะห์พิเศษหรือโปรตีนเรืองแสงที่ทำหน้าที่คล้ายกันซึ่งสามารถเปิดใช้งานได้ด้วยการกะพริบแสงสั้น ๆ ของรังสียูวีหรือไวโอเล็ต การเปิดใช้งานด้วยแสงและ FRAP สามารถใช้เป็นเทคนิคเสริมเพื่อกำหนดพารามิเตอร์การเคลื่อนที่
ในเทคนิคที่เกี่ยวข้องกับ FRAP เรียกว่าการสูญเสียการเรืองแสงหลังจากการฟอกสีด้วยแสง (FLIP) บริเวณเรืองแสงที่กำหนดภายในเซลล์ที่มีชีวิตผ่านการฟอกสีด้วยแสงซ้ำ ๆ โดยการฉายรังสีที่รุนแรง หากฟลูออโรฟอร์ทั้งหมดสามารถกระจายไปในบริเวณที่มีการฟอกสีด้วยแสงในช่วงเวลาที่วัดได้ สิ่งนี้จะส่งผลให้สัญญาณเรืองแสงทั่วทั้งเซลล์สูญเสียไปโดยสิ้นเชิง ด้วยการคำนวณอัตราที่ฟลูออเรสเซนซ์หายไปจากเซลล์ทั้งหมด จะสามารถกำหนดการเคลื่อนที่แบบกระจายของฟลูออโรฟอร์เป้าหมายได้ นอกจากนี้ FLIP ยังสามารถระบุตำแหน่งและลักษณะของสิ่งกีดขวางการแพร่กระจายใดๆ ระหว่างช่องต่างๆ ของเซลล์ เช่น สิ่งกีดขวางระหว่างโสมและแอกซอนของเซลล์ประสาท
สเปกโทรสโกปีสหสัมพันธ์ฟลูออเรสเซนซ์ (FCS) ส่วนใหญ่ใช้ในกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลสแกนด้วยเลเซอร์หรือกล้องจุลทรรศน์มัลติโฟตอน เป็นวิธีที่ออกแบบมาเพื่อกำหนดข้อมูลจลนพลศาสตร์ เช่น อัตราการเกิดปฏิกิริยาเคมี ค่าสัมประสิทธิ์การแพร่กระจาย เทคนิคสำหรับน้ำหนักโมเลกุล อัตราการไหล และการรวมตัว ใน FCS ปริมาตรขนาดเล็ก (ประมาณหนึ่งเฟมโตมิเตอร์ โฟกัสที่จำกัดการเลี้ยวเบนของเลเซอร์) จะส่องสว่างด้วยลำแสงเลเซอร์ที่โฟกัสเพื่อบันทึกความผันผวนของความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์อัตโนมัติที่เกิดจากไดนามิกของโมเลกุลของฟลูออเรสเซนต์เป็นฟังก์ชันของเวลาในปริมาตรที่ฟลูออเรสเซนต์ครอบครอง โมเลกุล (รูปที่ 10) ฟลูออโรฟอร์ที่มีขนาดค่อนข้างเล็กจะกระจายอย่างรวดเร็วในปริมาตรที่ส่องสว่าง ทำให้เกิดความเข้มแบบสุ่มเป็นช่วงสั้นๆ ในทางกลับกัน คอมเพล็กซ์ที่ใหญ่กว่า (ฟลูออโรฟอร์จับกับโมเลกุลขนาดใหญ่) เคลื่อนที่ช้ากว่า ทำให้เกิดรูปแบบความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์ที่นานขึ้นและคงอยู่นานกว่า
เมื่อโครงสร้างที่ติดฉลากเรืองแสงอัดแน่นและทับซ้อนกันในบริเวณเฉพาะของเซลล์สิ่งมีชีวิต การวิเคราะห์ไดนามิกและการกระจายเชิงพื้นที่นั้นทำได้ยาก กล้องจุลทรรศน์เฉพาะจุดฟลูออเรสเซนส์ (FSM) เป็นเทคนิคที่เข้ากันได้กับรูปแบบการถ่ายภาพเกือบทั้งหมดที่ใช้ประโยชน์จากหน่วยย่อยที่มีฉลากเรืองแสงที่มีความเข้มข้นต่ำมาก ลดการเรืองแสงที่ไม่อยู่ในโฟกัส และปรับปรุงการมองเห็นโครงสร้างที่ติดฉลากและไดนามิกของพวกมันในบริเวณที่มีความหนา FSM ถูกนำมาใช้โดยการติดฉลากเพียงเศษเสี้ยวของโครงสร้างที่น่าสนใจทั้งหมด ในแง่นี้ FSM คล้ายกับการแสดง FCS ในมุมมองทั้งหมด แม้ว่าจะเน้นไปที่รูปแบบเชิงพื้นที่มากกว่าการวิเคราะห์เชิงปริมาณเชิงเวลา กล้องจุลทรรศน์เฉพาะจุดเรืองแสงมีประโยชน์อย่างยิ่งในการพิจารณาการเคลื่อนที่และการรวมตัวขององค์ประกอบไซโตสเกเลทัล เช่น แอกตินและไมโครทูบูลในเซลล์ซึ่งกระทำมากกว่าปก
กล้องจุลทรรศน์พร่องการแผ่รังสีกระตุ้น (STED) เป็นเทคนิคความละเอียดสูงที่เกิดขึ้นใหม่ซึ่งมีความละเอียดเชิงพื้นที่เกินขีดจำกัดการเลี้ยวเบน โดยใช้แสงพร่องรูปวงแหวนเพื่อล้อมรอบลำแสงกระตุ้นที่มีขนาดเล็กกว่าเพื่อให้ได้ sub-50 nm บนแกนถึง ความละเอียด เทคนิคนี้ขึ้นอยู่กับการกระตุ้นของฟลูออโรฟอร์ด้วยพัลส์เลเซอร์ที่ซิงโครไนซ์และพัลส์ STED แบบวงกลมที่ประสานงานเชิงพื้นที่ซึ่งทำให้แสงที่ปล่อยออกมาหมดไป ยับยั้งการเรืองแสงของโมเลกุลที่กระตุ้นรอบโฟกัสการสแกนด้วยเลเซอร์ การเรืองแสงที่เกิดขึ้นที่ขอบของจุดจะถูกระงับ แต่ไม่อยู่ที่กึ่งกลางของจุด จึงลดขนาดของจุดเรืองแสงได้อย่างมากและเพิ่มความละเอียดที่สอดคล้องกันอย่างมีนัยสำคัญ STED ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์สำหรับการตรวจจับเซลล์ที่มีชีวิตความละเอียดสูง เทคนิคความละเอียดสูงที่เกิดขึ้นใหม่อื่นๆ เช่น กล้องจุลทรรศน์แบบระบุตำแหน่งด้วยแสง (PALM) และกล้องจุลทรรศน์แบบส่องสว่างที่มีโครงสร้าง (SIM) จะกลายเป็นเครื่องมือพื้นฐานสำหรับการถ่ายภาพเซลล์ที่มีชีวิตในอนาคตอันใกล้นี้
การใช้ที่เพิ่มขึ้นของโปรตีนเรืองแสงที่เข้ารหัสทางพันธุกรรมและฟลูออโรฟอร์สังเคราะห์ขั้นสูงสำหรับการถ่ายภาพเซลล์ที่มีชีวิตเปิดประตูสู่โมดูลออปติคัลใหม่สำหรับการตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงทางโลกและความสัมพันธ์เชิงพื้นที่ ขณะนี้นักจุลทรรศน์มีชุดเครื่องมือครบชุดในการสังเกตและบันทึกข้อมูลภาพของกระบวนการระดับเซลล์ที่เกิดขึ้นในช่วงเวลาที่หลากหลายและหลายความละเอียด สามารถสังเกตและบันทึกเหตุการณ์ที่ช้ากว่าได้อย่างง่ายดายโดยใช้เลเซอร์สแกนคอนโฟคอลไมโครสโคป ในขณะที่สามารถรับเหตุการณ์จลนพลศาสตร์ที่เร็วขึ้นได้โดยใช้เทคโนโลยีจานหมุน นอกจากนี้ กล้องจุลทรรศน์แบบมัลติโฟตอนยังช่วยให้ถ่ายภาพได้ลึกในเนื้อเยื่อหนา และเทคนิคการสะท้อนกลับทั้งหมดช่วยให้สามารถตรวจสอบพื้นผิวเมมเบรนได้อย่างแม่นยำ วิธีการเรืองแสงขั้นสูง เช่น FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM และ STED สามารถใช้ตรวจสอบปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนกับโปรตีนที่ความละเอียดมักจะดีกว่าที่อนุญาตโดยขีดจำกัดการเลี้ยวเบน ด้วยความก้าวหน้าของเทคโนโลยีฟลูออโรฟอร์ กล้องจุลทรรศน์ และเครื่องตรวจจับ โลกที่กว้างขึ้นจะถูกนำเข้ามา "ภายใต้กล้องจุลทรรศน์"
