หลักการและโครงสร้างของกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ใช้แหล่งกำเนิดแสงจุดที่มีประสิทธิภาพการส่องสว่างสูง ซึ่งปล่อยความยาวคลื่นแสงที่แน่นอน (เช่น แสงอัลตราไวโอเลต 3650 นิ้ว หรือแสงสีม่วงสีน้ำเงิน 4200 นิ้ว) ผ่านระบบกรองสีเป็นแสงกระตุ้น และกระตุ้นสารเรืองแสงในตัวอย่างให้ เปล่งแสงเรืองแสงหลากสีสัน หลังจากนั้นจะสังเกตได้จากการขยายวัตถุและช่องมองภาพ ด้วยวิธีนี้ แม้ว่าแสงฟลูออเรสเซนต์จะอ่อน แต่ก็สามารถจดจำได้ง่ายและมีความไวสูงภายใต้พื้นหลังที่มีสีตัดกันสูง ซึ่งส่วนใหญ่ใช้สำหรับศึกษาโครงสร้างและการทำงานของเซลล์ ตลอดจนองค์ประกอบทางเคมี โครงสร้างพื้นฐานของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ประกอบด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงธรรมดาและอุปกรณ์เสริมบางอย่าง (เช่น แหล่งกำเนิดแสงฟลูออเรสเซนต์ ฟิลเตอร์กระตุ้น ตัวแยกลำแสงสองสี และฟิลเตอร์บล็อค ฯลฯ) แหล่งกำเนิดแสงจากหลอดฟลูออเรสเซนต์ - มักใช้หลอดปรอทความดันสูงพิเศษ (50-200W) ซึ่งสามารถเปล่งแสงที่มีความยาวคลื่นต่างๆ อย่างไรก็ตาม สารฟลูออเรสเซนต์แต่ละชนิดมีความยาวคลื่นของแสงกระตุ้นที่สร้างแสงเรืองแสงที่เข้มที่สุด ดังนั้นจึงจำเป็นต้องเพิ่มฟิลเตอร์กระตุ้น (โดยปกติคือฟิลเตอร์กระตุ้นรังสีอัลตราไวโอเลต สีม่วง น้ำเงิน และเขียว) เพื่อให้แสงกระตุ้นเพียงความยาวคลื่นบางช่วงเท่านั้นที่จะผ่านและส่องสว่างได้ ชิ้นงานในขณะที่ดูดซับแสงอื่นๆ ทั้งหมด หลังจากถูกฉายรังสีด้วยแสงที่ตื่นเต้น สสารแต่ละชนิดจะปล่อยแสงเรืองแสงที่มองเห็นได้ซึ่งมีความยาวคลื่นยาวกว่าการฉายรังสีในระยะเวลาอันสั้นมาก แสงฟลูออเรสเซนต์มีความเฉพาะเจาะจงและโดยทั่วไปจะอ่อนกว่าแสงกระตุ้น ในการสังเกตการเรืองแสงที่เฉพาะเจาะจง จำเป็นต้องเพิ่มฟิลเตอร์ปิดกั้น (หรือระงับ) ไว้ด้านหลังเลนส์ใกล้วัตถุ โดยมีหน้าที่สองประการ ประการแรก จะดูดซับและปิดกั้นแสงกระตุ้นไม่ให้เข้าสู่ช่องมองภาพ เพื่อหลีกเลี่ยงไม่ให้แสงฟลูออเรสเซนต์รบกวนและทำให้ดวงตาเสียหาย ประการที่สอง จะเลือกและอนุญาตให้แสงฟลูออเรสเซนต์เฉพาะเจาะจงผ่านไปได้ โดยแสดงสีเรืองแสงเฉพาะเจาะจง ต้องเลือกตัวกรองทั้งสองประเภทเพื่อใช้ร่วมกัน
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์มีสองประเภทตามเส้นทางแสง:
1. กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบส่องผ่าน: แหล่งกำเนิดแสงกระตุ้นจะถูกส่งผ่านวัสดุตัวอย่างผ่านคอนเดนเซอร์เพื่อกระตุ้นการเรืองแสง ตัวสะสมแสงสนามมืดหรือตัวสะสมแสงทั่วไปที่ใช้กันทั่วไป สามารถใช้เพื่อปรับตัวสะท้อนแสงเพื่อแปลงแสงกระตุ้นและแสงด้านข้างไปที่ชิ้นงานทดสอบ นี่เป็นกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงที่ค่อนข้างล้าสมัย ข้อได้เปรียบของมันคือการเรืองแสงมีความเข้มสูงเมื่อใช้กำลังขยายต่ำ ในขณะที่ข้อเสียคือ การเรืองแสงจะอ่อนลงเมื่อกำลังขยายเพิ่มขึ้น ดังนั้นจึงเป็นการดีกว่าสำหรับการสังเกตวัสดุตัวอย่างที่มีขนาดใหญ่กว่า
2. กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบลำแสงตก เป็นกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ชนิดใหม่ที่พัฒนาขึ้นในยุคปัจจุบัน ต่างจากครั้งก่อน แสงกระตุ้นจะตกลงมาจากเลนส์ใกล้วัตถุถึงพื้นผิวของชิ้นงานทดสอบ โดยใช้เลนส์ใกล้วัตถุตัวเดียวกันกับคอนเดนเซอร์ส่องสว่างและเลนส์ใกล้วัตถุเพื่อรวบรวมสารเรืองแสง จำเป็นต้องเพิ่มตัวแยกลำแสงสีคู่ในเส้นทางแสงซึ่งอยู่ที่มุม 45 องศากับยูเรเนียมเบา แสงกระตุ้นจะสะท้อนเข้าสู่เลนส์ใกล้วัตถุและมุ่งไปที่ตัวอย่าง แสงฟลูออเรสเซนต์ที่สร้างโดยตัวอย่าง เช่นเดียวกับแสงกระตุ้นที่สะท้อนจากพื้นผิวของเลนส์ใกล้วัตถุและกระจกครอบ จะเข้าสู่เลนส์ใกล้วัตถุพร้อมกันและกลับไปยังตัวแยกลำแสงไดโครอิก เพื่อแยกแสงกระตุ้นและแสงฟลูออเรสเซนต์ การกระตุ้นที่ตกค้างจะถูกดูดซับโดยตัวกรองที่ปิดกั้น หากใช้ตัวกรองการกระตุ้น/ตัวแยกลำแสงสีคู่/ตัวกรองการปิดกั้นที่แตกต่างกัน ตัวกรองเหล่านี้จะสามารถตอบสนองความต้องการของผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาเรืองแสงที่แตกต่างกันได้ ข้อดีของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์นี้คือ สนามการมองเห็นมีความสม่ำเสมอ ภาพมีความชัดเจน และยิ่งกำลังขยายมากเท่าใด แสงฟลูออเรสเซนต์ก็จะยิ่งแข็งแกร่งขึ้นเท่านั้น
