ลักษณะทางเทคนิคและทักษะการใช้งานกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบสองโฟตอน
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบสองโฟตอนเป็นเทคโนโลยีใหม่ที่รวมกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลสแกนด้วยเลเซอร์และเทคโนโลยีกระตุ้นโฟตอนแบบสองโฟตอน
หลักการพื้นฐานของการกระตุ้นสองโฟตอนคือ: ในกรณีของโฟตอนที่มีความหนาแน่นสูง โมเลกุลของฟลูออเรสเซนต์สามารถดูดซับโฟตอนที่มีความยาวคลื่นยาวสองตัวได้ในเวลาเดียวกัน และปล่อยโฟตอนที่มีความยาวคลื่นสั้นกว่าหลังจากช่วงเวลาสั้น ๆ ของสิ่งที่เรียกว่าสถานะกระตุ้น . ; ผลจะเหมือนกับการใช้โฟตอนที่มีความยาวคลื่นครึ่งหนึ่งของความยาวคลื่นยาวเพื่อกระตุ้นโมเลกุลเรืองแสง การกระตุ้นโฟตอนแบบสองต้องการความหนาแน่นของโฟตอนสูง เพื่อไม่ให้เซลล์เสียหาย กล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอนใช้เลเซอร์พัลซิ่งแบบล็อกโหมดพลังงานสูง เลเซอร์ที่ปล่อยออกมาจากเลเซอร์นี้มีพลังงานสูงสุดสูงและพลังงานเฉลี่ยต่ำ ความกว้างพัลส์ของมันอยู่ที่ 100 เฟมโตวินาทีเท่านั้น และคาบของมันสามารถสูงถึง 80 ถึง 100 เมกะเฮิรตซ์ เมื่อใช้เลนส์ใกล้วัตถุที่มีรูรับแสงเป็นตัวเลขสูงเพื่อโฟกัสโฟตอนของเลเซอร์พัลซิ่ง ความหนาแน่นของโฟตอนที่จุดโฟกัสของเลนส์ใกล้วัตถุจะสูงที่สุด และการกระตุ้นโฟตอนแบบสองโฟตอนจะเกิดขึ้นที่จุดโฟกัสของเลนส์ใกล้วัตถุเท่านั้น ดังนั้น กล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอนไม่จำเป็นต้องมีรูเข็มแบบคอนโฟคอล ซึ่งช่วยปรับปรุงประสิทธิภาพการตรวจจับฟลูออเรสเซนซ์ เป็นวิธีการวิจัยที่สำคัญในด้านสัณฐานวิทยา ชีววิทยาระดับโมเลกุล ประสาทวิทยาศาสตร์ และเภสัชวิทยา
1. ภูมิหลังของการเกิดขึ้นของกล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอน - ข้อจำกัดสองประการของกล้องจุลทรรศน์แบบเลเซอร์คอนโฟคอลแบบดั้งเดิม:
1) หนึ่งคือปรากฏการณ์ความเป็นพิษต่อแสง: เนื่องจากรูเข็มคอนโฟคอลต้องเล็กพอที่จะได้ภาพที่มีความละเอียดสูง และรูรับแสงขนาดเล็กจะปิดกั้นส่วนใหญ่ของการเรืองแสงที่ปล่อยออกมาจากตัวอย่าง รวมทั้งการเรืองแสงที่ปล่อยออกมาจากระนาบโฟกัส ใช่ ที่สอดคล้องกัน ไฟกระตุ้นต้องแรงพอที่จะได้อัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนที่เพียงพอ และเลเซอร์ความเข้มสูงจะทำให้สีย้อมเรืองแสงจางลงอย่างรวดเร็วระหว่างการสแกนอย่างต่อเนื่อง และสัญญาณเรืองแสงจะอ่อนลงเรื่อยๆ เมื่อการสแกนดำเนินไป
2) ความเป็นพิษต่อแสงเป็นอีกปัญหาหนึ่ง ภายใต้การฉายรังสีด้วยเลเซอร์ โมเลกุลของสีย้อมเรืองแสงจำนวนมากจะผลิตไซโตทอกซิน เช่น ออกซิเจนเดี่ยวหรืออนุมูลอิสระ ดังนั้นเวลาในการสแกนและความหนาแน่นของพลังงานแสงของแสงกระตุ้นควรถูกจำกัดในการทดลองเพื่อรักษาความหนาแน่นของตัวอย่าง คล่องแคล่ว. ในการวิจัยเกี่ยวกับตัวอย่างที่ออกฤทธิ์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งระยะต่างๆ ของการเจริญเติบโตและการพัฒนาของตัวอย่างที่ออกฤทธิ์ การฟอกสีด้วยแสงและความเป็นพิษต่อแสงทำให้การศึกษาเหล่านี้มีข้อจำกัดมาก
2. ทำไมคุณถึงบอกว่าโดยทั่วไปแล้วกล้องจุลทรรศน์สองโฟตอนไม่จำเป็นต้องติดตั้งเลเซอร์กระตุ้นรังสีอัลตราไวโอเลต
กล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอนเป็นเทคโนโลยีการกระตุ้นด้วยแสงโดยใช้เอฟเฟกต์การกระตุ้นแบบสองโฟตอน: โมเลกุลของสีย้อมเรืองแสงสามารถถูกกระตุ้นได้โดยการดูดซับโฟตอนพลังงานต่ำสองตัวพร้อมกัน (ช่วงเวลาระหว่างโฟตอนสองตัวที่ไปถึงโมเลกุลเรืองแสงน้อยกว่า 1 เฟมโตวินาที ) ผลการกระตุ้นสามารถเทียบเท่ากับการดูดซับโฟตอนพลังงานสูงที่ 1/2 ความยาวคลื่น ตัวอย่างเช่น การดูดซับโฟตอนที่ความยาวคลื่นสีแดงจะเทียบเท่ากับโมเลกุลที่ดูดซับรังสีอัลตราไวโอเลต โฟตอนที่มีความยาวคลื่นยาวจะไม่ถูกดูดซับโดยเซลล์อย่างง่ายดาย ดังนั้นความเป็นพิษต่อแสงต่อเซลล์ของสิ่งมีชีวิตจึงลดลง และการฟอกสีด้วยแสงก็ลดลงเช่นกัน ด้วยวิธีนี้ ไม่เพียงแต่ทำหน้าที่กระตุ้นรังสีอัลตราไวโอเลตเท่านั้น แต่ยังหลีกเลี่ยงความเสียหายของแสงอัลตราไวโอเลตต่อตัวอย่างอีกด้วย
3. เลเซอร์ของกล้องจุลทรรศน์สองโฟตอนมีความพิเศษอย่างไร
ความน่าจะเป็นของการดูดกลืนสองโฟตอนขึ้นอยู่กับว่าโฟตอนทั้งสองตกกระทบกันในอวกาศและเวลาใกล้เคียงกันเพียงใด (โฟตอนทั้งสองจะต้องมาถึงภายใน 10-18 วินาที) ภาพตัดขวางการดูดกลืนสองโฟตอนมีขนาดเล็ก และมีเพียงฟลูออโรฟอร์ในบริเวณที่มีฟลักซ์โฟตอนมากเท่านั้นที่ตื่นเต้น ดังนั้น เลเซอร์ส่วนใหญ่ที่ใช้คือเลเซอร์ไททาเนียมแซฟไฟร์ ซึ่งสามารถสแกนด้วยความเร็วพิโควินาทีหรือเฟมโตวินาที และมีกำลังสูงสุดสูงมากและกำลังเฉลี่ยต่ำ ดังนั้นการฟอกสีด้วยแสงและความเป็นพิษต่อแสงจึงลดลงหรือกำจัดได้ สิ่งที่สำคัญที่สุดคือการให้โฟตอนที่มีความหนาแน่นสูงมากในช่วงเล็กๆ ซึ่งสามารถรับประกันได้ว่าโฟตอนสองตัวจะกระตุ้นพร้อมกัน
4. ข้อดีของการกระตุ้นด้วยโฟตอนสองแบบคืออะไร?
1) เพิ่มการเลือกสีย้อม: ช่วงแสงกระตุ้นของเลเซอร์ระบบคอนโฟคอล (Ar, Ar/Kr, HeNe) คือ 488nm - 647nm ซึ่งหมายถึงการทดลองกับสีเรืองแสงที่กระตุ้นด้วยรังสียูวี เช่น กับ DAPI , Hoescht ความยาวคลื่นกระตุ้นของโฟตอนสองแสงเป็นสองเท่าของโฟตอนเดี่ยว ดังนั้นสีย้อมที่กระตุ้นด้วยรังสีอัลตราไวโอเลตจึงสามารถถูกกระตุ้นด้วยแสงอินฟราเรดใกล้
2) ลด photobleaching: เนื่องจากการลดลงของ photobleaching อัตราความสำเร็จของการทดลองโดยใช้ CFP/YFP สำหรับการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสง (FRET) จะเพิ่มขึ้น
3) ไม่จำเป็นต้องใช้เลนส์ใกล้วัตถุพิเศษ: จากมุมมองของฮาร์ดแวร์ การกระตุ้นของสีย้อมที่กระตุ้นรังสียูวีด้วยความยาวคลื่นของแสงอินฟราเรดใกล้ไม่จำเป็นต้องใช้ส่วนประกอบออปติคัลยูวีพิเศษ
4) ปรับปรุงอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวน: ความยาวคลื่นแสงกระตุ้นและความยาวคลื่นแสงที่ปล่อยออกมามีความแตกต่างกันมาก ซึ่งช่วยปรับปรุงอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวน
5) การฟอกสีเฉพาะที่จุดโฟกัส: เนื่องจากการกระตุ้นด้วยแสงฟลูออเรสเซนซ์เกิดขึ้นที่จุดโฟกัสของวัตถุเท่านั้น จึงไม่จำเป็นต้องมีรูเข็มคอนโฟคอล ซึ่งช่วยปรับปรุงการตรวจจับแสงและการฟอกสีด้วยแสงจะเกิดขึ้นที่จุดโฟกัสเท่านั้น
6) เจาะชิ้นงานได้ง่ายกว่า: แสงความยาวคลื่นอินฟราเรดไม่กระจายไปตามเซลล์ได้ง่ายและสามารถเจาะชิ้นงานได้ลึกกว่า
5. เมื่อเทียบกับกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบสแกนด้วยเลเซอร์ ข้อใดคือการปรับปรุงที่ใหญ่ที่สุดของกล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอน
1) ลดการฟอกสีด้วยแสง
2) ลดความเป็นพิษต่อแสง
3) มันไม่ง่ายที่จะกระจาย และมันง่ายกว่าที่จะเจาะตัวอย่างที่มีความหนา เช่น ชิ้นสมอง
