ความแตกต่างระหว่างกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ (สองโฟตอน, confocal) และกล้องจุลทรรศน์ทั่วไป
หลักการพื้นฐานของการกระตุ้นสองโฟตอนคือที่ความหนาแน่นของโฟตอนสูงโมเลกุลของฟลูออเรสเซนต์สามารถดูดซับโฟตอนที่มีความยาวคลื่นยาวสองตัวพร้อมกันและปล่อยโฟตอนที่มีความยาวคลื่นสั้นลงหลังจากช่วงเวลาสั้น ๆ เอฟเฟกต์นั้นเหมือนกับการใช้โฟตอนที่มีความยาวคลื่นครึ่งหนึ่งของความยาวคลื่นยาวเพื่อกระตุ้นโมเลกุลของฟลูออเรสเซนต์ การกระตุ้นด้วยโฟตอนสองครั้งนั้นต้องใช้ความหนาแน่นของโฟตอนสูงและเพื่อหลีกเลี่ยงเซลล์ที่สร้างความเสียหายกล้องจุลทรรศน์สองโฟตอนใช้เลเซอร์พัลส์ที่ล็อคโหมดพลังงานสูง เลเซอร์ที่ปล่อยออกมาโดยเลเซอร์นี้มีพลังงานสูงสุดสูงและพลังงานเฉลี่ยต่ำโดยมีความกว้างพัลส์เพียง 100 femtoseconds และความถี่สูงถึง 80 ถึง 100 เมกะเฮิร์ตซ์ เมื่อใช้เลนส์วัตถุประสงค์ของรูรับแสงที่มีตัวเลขสูงเพื่อมุ่งเน้นโฟตอนของเลเซอร์พัลซิ่งความหนาแน่นโฟตอนที่จุดโฟกัสของเลนส์วัตถุประสงค์คือการกระตุ้นสูงสุดและสองโฟตอนจะเกิดขึ้นที่จุดโฟกัสของเลนส์วัตถุประสงค์ ดังนั้นกล้องจุลทรรศน์สองโฟตอนไม่จำเป็นต้องใช้รูเข็ม confocal ซึ่งช่วยเพิ่มประสิทธิภาพของการตรวจจับการเรืองแสง
ในปรากฏการณ์ฟลูออเรสเซนต์ทั่วไปเนื่องจากความหนาแน่นของโฟตอนต่ำของแสงกระตุ้นโมเลกุลฟลูออเรสเซนต์สามารถดูดซับโฟตอนทีละโฟตอนแล้วปล่อยโฟตอนฟลูออเรสเซนต์อื่นผ่านการเปลี่ยนผ่านรังสีซึ่งเรียกว่าฟลูออเรสเซนต์เดี่ยว สำหรับกระบวนการกระตุ้นการเรืองแสงโดยใช้เลเซอร์เป็นแหล่งกำเนิดแสงอาจเกิดปรากฏการณ์ฟลูออเรสเซนต์สองโฟตอนหรือหลายรูปแบบ ในกรณีนี้แหล่งกำเนิดแสงกระตุ้นที่ใช้มีความเข้มสูงและความหนาแน่นของโฟตอนที่ตรงกับความต้องการสำหรับโมเลกุลของฟลูออเรสเซนต์เพื่อดูดซับโฟตอนสองตัวพร้อมกัน ในกระบวนการใช้เลเซอร์ทั่วไปเป็นแหล่งกำเนิดแสงความหนาแน่นโฟตอนยังไม่เพียงพอที่จะสร้างปรากฏการณ์การดูดซับสองโฟตอน โดยทั่วไปแล้วจะใช้เลเซอร์พัลส์ femtosecond โดยใช้พลังงานทันทีถึงระดับ megawatt ดังนั้นความยาวคลื่นของฟลูออเรสเซนต์สองโฟตอนนั้นสั้นกว่าแสงกระตุ้นเทียบเท่ากับผลที่เกิดจากการกระตุ้นความยาวคลื่นการกระตุ้นครึ่งหนึ่ง
ความรู้ที่เกี่ยวข้องกับกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบ confocal
หลักการพื้นฐานของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์คอนโฟคอลคือการใช้แหล่งกำเนิดแสงจุดเพื่อฉายตัวอย่างตัวอย่างซึ่งเป็นจุดแสงขนาดเล็กที่กำหนดไว้อย่างดีบนระนาบโฟกัส ฟลูออเรสเซนต์ที่ปล่อยออกมาจากจุดนี้หลังจากการฉายรังสีถูกรวบรวมโดยเลนส์วัตถุประสงค์และส่งกลับไปตามเส้นทางการฉายรังสีดั้งเดิมไปยังตัวแยกลำแสงที่ประกอบด้วยกระจก dichroic สเปกโตรมิเตอร์ส่งฟลูออเรสเซนต์โดยตรงไปยังเครื่องตรวจจับ มีรูเข็มด้านหน้าของทั้งแหล่งกำเนิดแสงและเครื่องตรวจจับเรียกว่ารูพรุนการส่องสว่างและรูเข็มการตรวจจับตามลำดับ ขนาดเรขาคณิตของทั้งสองมีความสอดคล้องกันประมาณ 100-200 nm; เมื่อเปรียบเทียบกับจุดแสงบนระนาบโฟกัสทั้งสองเป็นคอนจูเกตซึ่งหมายความว่าจุดแสงจะผ่านชุดของเลนส์และในที่สุดก็สามารถมุ่งเน้นไปที่การส่องสว่างทั้งรูพรุนและรูพรุนการตรวจจับพร้อมกัน ด้วยวิธีนี้แสงจากระนาบโฟกัสสามารถมาบรรจบกันภายในช่วงของรูตรวจจับในขณะที่แสงที่กระจัดกระจายจากด้านบนหรือใต้ระนาบโฟกัสจะถูกปิดกั้นนอกรูตรวจจับและไม่สามารถถ่ายภาพได้ การสแกนตัวอย่างทีละจุดด้วยเลเซอร์ท่อโฟโตมิลเทียร์หลังจากตรวจจับรูเข็มยังได้รับภาพ confocal ที่สอดคล้องกันของจุดแสงทีละจุดแปลงเป็นสัญญาณดิจิตอลและส่งไปยังคอมพิวเตอร์
