วัตถุประสงค์ คุณลักษณะ และการใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง
หลักการและลักษณะโครงสร้างของกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง: กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงใช้แหล่งกำเนิดแสงแบบจุดที่มีประสิทธิภาพการส่องสว่างสูงเพื่อปล่อยแสงความยาวคลื่นหนึ่ง (เช่นแสงอัลตราไวโอเลต 3650 นิ้วหรือแสงสีม่วงสีน้ำเงิน 4200 นิ้ว) ผ่านระบบกรองเป็นตัวกระตุ้น แสงเพื่อกระตุ้นการเรืองแสงในชิ้นงาน หลังจากที่สารนี้ปล่อยแสงเรืองแสงสีต่างๆ ออกมา จะสังเกตได้จากการขยายของเลนส์ใกล้วัตถุและเลนส์ใกล้ตา ด้วยวิธีนี้ ภายใต้พื้นหลังที่มีคอนทราสต์สูง แม้ว่าฟลูออเรสเซนซ์จะอ่อนมาก แต่ก็สามารถระบุได้ง่ายและมีความไวสูง ส่วนใหญ่ใช้สำหรับการวิจัยโครงสร้างและหน้าที่ของเซลล์และองค์ประกอบทางเคมี โครงสร้างพื้นฐานของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ประกอบด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงทั่วไปและอุปกรณ์เสริมบางอย่าง (เช่น แหล่งกำเนิดแสงจากหลอดฟลูออเรสเซนต์ ฟิลเตอร์กระตุ้น ตัวแยกลำแสงสองสี และฟิลเตอร์ปิดกั้น ฯลฯ) แหล่งกำเนิดแสงฟลูออเรสเซนต์—โดยทั่วไปใช้หลอดปรอทความดันสูงพิเศษ (50-200W) ซึ่งสามารถเปล่งแสงที่มีความยาวคลื่นต่างๆ ได้ แต่สารเรืองแสงแต่ละชนิดมีความยาวคลื่นกระตุ้นที่ทำให้เกิดการเรืองแสงที่แรงที่สุด ดังนั้น ตัวกรองการกระตุ้น ( โดยทั่วไป มีฟิลเตอร์กระตุ้นรังสีอัลตราไวโอเลต สีม่วง สีน้ำเงิน และสีเขียว) ซึ่งอนุญาตให้แสงกระตุ้นที่มีความยาวคลื่นหนึ่งผ่านและฉายรังสีไปยังชิ้นงานในขณะที่ดูดซับแสงอื่นๆ หลังจากที่สารแต่ละชนิดถูกฉายรังสีด้วยแสงกระตุ้น มันจะปล่อยแสงเรืองแสงที่มองเห็นได้ด้วยความยาวคลื่นที่ยาวกว่าความยาวคลื่นที่ฉายออกมาในเวลาอันสั้น การเรืองแสงมีความเฉพาะเจาะจงและโดยทั่วไปจะอ่อนกว่าแสงกระตุ้น ในการสังเกตการเรืองแสงที่เฉพาะเจาะจง จำเป็นต้องใช้ฟิลเตอร์ปิดกั้น (หรือยับยั้ง) ด้านหลังเลนส์ใกล้วัตถุ
มีหน้าที่สองประการ: ประการแรกดูดซับและปิดกั้นแสงกระตุ้นไม่ให้เข้าสู่ช่องมองภาพ เพื่อไม่ให้รบกวนแสงเรืองแสงและทำให้ดวงตาเสียหาย อีกวิธีหนึ่งคือการเลือกและปล่อยให้สารเรืองแสงเจาะจงผ่านไป โดยแสดงสีเรืองแสงเฉพาะ ต้องใช้ตัวกรองสองตัวร่วมกัน
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์มี 2 ประเภทในแง่ของเส้นทางแสง:
1. กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบส่องผ่าน: แหล่งกำเนิดแสงกระตุ้นจะถูกส่งผ่านวัสดุตัวอย่างผ่านเลนส์คอนเดนเซอร์เพื่อกระตุ้นการเรืองแสง โดยทั่วไปจะใช้ตัวเก็บสนามมืด และตัวเก็บธรรมดายังสามารถใช้เพื่อปรับกระจกเพื่อให้แสงกระตุ้นถูกเปลี่ยนทิศทางและบายพาสไปยังชิ้นงานทดสอบ นี่คือกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์รุ่นเก่า ข้อดีคือฟลูออเรสเซนส์จะแรงเมื่อใช้กำลังขยายต่ำ แต่ข้อเสียคือฟลูออเรสเซนต์จะลดลงเมื่อขยายเพิ่มขึ้น ดังนั้นจึงเป็นการดีกว่าที่จะสังเกตวัสดุตัวอย่างที่มีขนาดใหญ่กว่า
2. Epi-fluorescence microscope เป็นกล้องจุลทรรศน์ชนิดใหม่ที่พัฒนาขึ้นในยุคปัจจุบัน ข้อแตกต่างคือแสงกระตุ้นจะตกจากเลนส์ใกล้วัตถุลงไปยังพื้นผิวของชิ้นงานทดสอบ กล่าวคือ เลนส์ใกล้วัตถุอันเดียวกันจะใช้เป็นคอนเดนเซอร์ส่องสว่างและเลนส์ใกล้วัตถุสำหรับเก็บสารเรืองแสง ต้องเพิ่มตัวแยกลำแสงไดโครอิกในเส้นทางแสง ซึ่งอยู่ห่างจากยูเรเนียมเบา 45 องศา แสงกระตุ้นจะสะท้อนเข้าสู่เลนส์ใกล้วัตถุและเก็บรวบรวมไว้ที่ตัวอย่าง การเรืองแสงที่เกิดจากตัวอย่างและแสงกระตุ้นที่สะท้อนจากผิวเลนส์ของเลนส์ใกล้วัตถุและพื้นผิวกระจกครอบจะเข้าสู่เลนส์ใกล้วัตถุพร้อมกัน และกลับไปที่ตัวแยกลำแสงสองสีเพื่อทำให้แสงกระตุ้นแยกออกจากสารเรืองแสง , แสงกระตุ้นที่เหลือจะถูกดูดซับโดยการปิดกั้นตัวกรอง เช่น การเปลี่ยนชุดฟิลเตอร์กระตุ้น/ตัวแยกลำแสงสองสี/ฟิลเตอร์บล็อก ซึ่งสามารถตอบสนองความต้องการของผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาเรืองแสงต่างๆ ได้ ข้อได้เปรียบของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนส์ชนิดนี้คือการส่องสว่างของขอบเขตการมองเห็นที่สม่ำเสมอ ภาพที่ได้มีความชัดเจน และยิ่งกำลังขยายมากเท่าใด ฟลูออเรสเซนต์ก็จะยิ่งแข็งแกร่ง
(2) วิธีการใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง
1. เปิดแหล่งกำเนิดแสง และหลอดปรอทความดันสูงพิเศษจำเป็นต้องอุ่นเครื่องสักสองสามนาทีจึงจะถึงจุดที่สว่างที่สุด
2. กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบส่องผ่านจำเป็นต้องติดตั้งตัวกรองการกระตุ้นที่จำเป็นระหว่างแหล่งกำเนิดแสงและคอนเดนเซอร์ และติดตั้งตัวกรองการปิดกั้นที่สอดคล้องกันด้านหลังเลนส์ใกล้วัตถุ กล้องจุลทรรศน์แบบ Epi-fluorescence จำเป็นต้องใส่ตัวกรองกระตุ้น/ตัวแยกลำแสงสองสี/ตัวกรองการปิดกั้นที่ต้องการเข้าไปในช่องในเส้นทางแสง
3. สังเกตด้วยเลนส์กำลังขยายต่ำ และปรับจุดศูนย์กลางของแหล่งกำเนิดแสงให้อยู่กึ่งกลางของจุดรับแสงทั้งหมดตามอุปกรณ์ปรับของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์รุ่นต่างๆ
4. วางชิ้นตัวอย่างและสังเกตหลังจากโฟกัส ควรให้ความสนใจระหว่างการใช้งาน: อย่าสังเกตโดยตรงกับตัวกรองท้ายเพื่อไม่ให้เกิดความเสียหายต่อดวงตา เมื่อสังเกตชิ้นงานด้วยเลนส์น้ำมัน คุณต้องใช้เลนส์น้ำมันชนิดพิเศษที่ไม่มีสารเรืองแสง หลังจากปิดหลอดปรอทความดันสูงแล้ว จะไม่สามารถเปิดได้อีกในทันที จำเป็นต้องทดสอบ สามารถเริ่มต้นใหม่ได้หลังจาก 5 นาที มิฉะนั้นจะไม่เสถียรและส่งผลต่ออายุการใช้งานของหลอดปรอท
(3) การสังเกตโดยใช้ตัวกรองแสงสีน้ำเงิน-ม่วงภายใต้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์บนแท่นสอน จะเห็นได้ว่า o. 01 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ที่ย้อมด้วยสีย้อมเรืองแสงสีส้มอะคริดีน นิวเคลียสและไซโตพลาสซึมตื่นเต้นที่จะผลิตสารเรืองแสงสองสีที่แตกต่างกัน (สีเขียวเข้มและสีแดงส้ม)
