ความสัมพันธ์ระหว่างกำลังขยายรวมและความละเอียดของกล้องจุลทรรศน์น้ำมันทางจุลชีววิทยา
โดยปกติแล้ว เลนส์ใกล้วัตถุสำหรับกล้องจุลทรรศน์ที่ใช้ในการวิจัยทางจุลชีววิทยาจะมีสามประเภท: เลนส์ใกล้วัตถุกำลังขยายต่ำแบบน้ำมัน (10×), เลนส์ใกล้วัตถุกำลังขยายสูง (40×) และเลนส์ใกล้วัตถุ ( 100×) นอกจากนี้ยังมีคำว่า "OI" (การแช่น้ำมัน) ซึ่งบ่งชี้ว่ามีกำลังขยายที่ใหญ่ที่สุดในบรรดาทั้งสามคำ ขึ้นอยู่กับการใช้เลนส์ใกล้ตาที่มีกำลังขยายต่างกัน วัตถุที่ถูกตรวจสอบสามารถขยายได้ 1000-1600 ครั้ง เมื่อใช้ ความแตกต่างระหว่างเลนส์น้ำมันกับเลนส์ใกล้วัตถุอื่นๆ คือ ไม่มีชั้นอากาศระหว่างสไลด์และเลนส์ใกล้วัตถุ แต่เป็นชั้นของน้ำมัน ซึ่งเรียกว่าระบบแช่น้ำมัน น้ำมันซีดาร์มักใช้เป็นน้ำมันนี้เนื่องจากดัชนีการหักเหของน้ำมันซีดาร์คือ n=1.52 ซึ่งเหมือนกับแก้ว เมื่อแสงผ่านกระจกสไลด์ก็สามารถเข้าสู่เลนส์ใกล้วัตถุได้โดยตรงผ่านน้ำมันซีดาร์โดยไม่มีการหักเหของแสง หากตัวกลางระหว่างกระจกสไลด์และเลนส์ใกล้วัตถุคืออากาศ จะเรียกว่าระบบแห้ง เมื่อแสงผ่านกระจกสไลด์ มันจะหักเหและกระเจิง และแสงที่เข้าสู่เลนส์ใกล้วัตถุจะลดลงอย่างเห็นได้ชัด ซึ่งจะลดความสว่างของขอบเขตการมองเห็น การใช้เลนส์น้ำมันไม่เพียงแต่ช่วยเพิ่มแสงสว่างเท่านั้น แต่ยังเพิ่มรูรับแสงเชิงตัวเลขด้วย เนื่องจากประสิทธิภาพการขยายของกล้องจุลทรรศน์ถูกกำหนดโดยรูรับแสงเชิงตัวเลข สิ่งที่เรียกว่ารูรับแสงตัวเลขเป็นผลคูณของครึ่งหนึ่งของไซน์ของมุมสูงสุดที่แสงฉายลงบนเลนส์ใกล้วัตถุ (เรียกว่ามุมเลนส์) คูณด้วยดัชนีการหักเหของตัวกลางระหว่างแผ่นกระจกและเลนส์ใกล้วัตถุ สามารถแสดงได้ด้วยสูตรต่อไปนี้: NA=n×sinа โดยที่ NA{{10}} ค่ารูรับแสงเชิงตัวเลข; n=ดัชนีการหักเหของตัวกลาง;=ครึ่งหนึ่งของมุมตกกระทบสูงสุด นั่นคือครึ่งหนึ่งของมุมปากกระจก ดังนั้น ยิ่งมุมที่แสงตกกระทบวัตถุมากเท่าใด ประสิทธิภาพของกล้องจุลทรรศน์ก็จะยิ่งมากขึ้นเท่านั้น ขนาดของมุมนี้จะถูกกำหนดโดยเส้นผ่านศูนย์กลางและทางยาวโฟกัสของวัตถุ ในเวลาเดียวกัน ขีดจำกัดทางทฤษฎีของ a คือ 90 - บาป90 =1 ดังนั้น เมื่อใช้อากาศเป็นตัวกลาง (n=1) ค่ารูรับแสงที่เป็นตัวเลขจะต้องไม่เกิน 1 ตัวอย่างเช่น เมื่อใช้น้ำมันซีดาร์เป็นตัวกลาง ค่า n จะเพิ่มขึ้น และค่ารูรับแสงที่เป็นตัวเลขก็เช่นกัน เพิ่มขึ้น ตัวอย่างเช่น ถ้ามุมตกกระทบของแสงคือ 120o และครึ่งหนึ่งของไซน์คือ sin60o=0.87 ดังนั้น เมื่อใช้อากาศเป็นตัวกลาง: NA{ {22}}×0.87=0.87 เมื่อใช้น้ำเป็นตัวกลาง: NA=1.33×0.87=1.15 เมื่อใช้น้ำมันซีดาร์เป็นตัวกลาง : NA =1.52×0.87=1.32 ความละเอียดของกล้องจุลทรรศน์หมายถึงความสามารถของกล้องจุลทรรศน์ในการแยกแยะระยะห่างต่ำสุดระหว่างจุดสองจุด เป็นสัดส่วนโดยตรงกับรูรับแสงตัวเลขของเลนส์ใกล้วัตถุ และเป็นสัดส่วนผกผันกับความยาวคลื่น ดังนั้น ยิ่งรูรับแสงตัวเลขของเลนส์ใกล้วัตถุมีขนาดใหญ่ขึ้นและความยาวคลื่นของคลื่นแสงก็จะสั้นลง ความละเอียดของกล้องจุลทรรศน์ก็จะยิ่งมากขึ้น และยังสามารถแยกแยะโครงสร้างเล็กๆ น้อยๆ ของวัตถุที่กำลังตรวจสอบได้ชัดเจนยิ่งขึ้น ดังนั้นความละเอียดสูงจึงหมายถึงระยะห่างที่สามารถแก้ไขได้เล็กน้อย ปัจจัยทั้งสองนี้มีความสัมพันธ์แบบผกผัน โดยปกติแล้วบางคนพูดถึงความละเอียดเป็นไมโครเมตรหรือนาโนเมตร สิ่งนี้ทำให้ความละเอียดสับสนกับระยะความละเอียดขั้นต่ำ ตื่น. กำลังการแยกส่วนของกล้องจุลทรรศน์แสดงด้วยระยะห่างขั้นต่ำที่สามารถแก้ไขได้ ระยะทางต่ำสุดที่สามารถแยกแยะได้ระหว่างจุดสองจุด=แลมบ์ดา/2NA โดยที่ แลมบ์ดา=ความยาวคลื่นของคลื่นแสง ความยาวเฉลี่ยของคลื่นแสงที่ตาเปล่าของเราสัมผัสได้คือ 0.55 ไมโครเมตร หากใช้เลนส์ใกล้วัตถุกำลังสูงที่มีรูรับแสงตัวเลข 0.65 จะสามารถแยกแยะระยะห่างระหว่างจุดสองจุดได้ คือ 0.42μm ไม่สามารถแยกแยะระยะห่างระหว่างจุดสองจุดที่ต่ำกว่า 0.42 μm ได้ แม้ว่าจะใช้ช่องมองภาพที่ใหญ่กว่าเพื่อเพิ่มกำลังขยายรวมของกล้องจุลทรรศน์ แต่ก็ยังไม่สามารถแยกแยะได้ วิธีแก้ปัญหาเดียวคือใช้เลนส์ใกล้วัตถุที่ใหญ่กว่าพร้อมรูรับแสงตัวเลขที่ใหญ่กว่าเพื่อเพิ่มความละเอียด ตัวอย่างเช่น เมื่อใช้เลนส์น้ำมันที่มีรูรับแสงตัวเลข 1.25 ระยะห่างขั้นต่ำระหว่างจุดสองจุดที่สามารถแยกแยะได้คือ=0.55/(2×1.25)=0.22μm ดังนั้น เราจะเห็นว่าหากใช้เลนส์ใกล้วัตถุกำลังสูง (NA=0.65) ที่มีกำลังขยาย 40 เท่า และใช้เลนส์ใกล้ตาที่มีกำลังขยาย 24 เท่า แม้ว่ากำลังขยายทั้งหมดจะอยู่ที่ 960 เท่าก็ตาม ความละเอียดขั้นต่ำเพียง 0.42 μm หากคุณใช้เลนส์น้ำมันที่มีกำลังขยาย 90 เท่า (NA=1.25) และเลนส์ใกล้ตาที่มีกำลังขยาย 9 เท่า แม้ว่ากำลังขยายรวมทั้งหมดจะอยู่ที่ 810 เท่า แต่คุณสามารถกำหนดระยะห่างที่ 0.22 μm ได้
