กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบสองโฟตอนมีข้อดีหลายประการ
1) แสงความยาวคลื่นยาวได้รับผลกระทบจากการกระเจิงน้อยกว่าแสงความยาวคลื่นสั้นและสามารถทะลุผ่านชิ้นงานทดสอบได้ง่าย
2) โมเลกุลของฟลูออเรสเซนต์ที่อยู่นอกระนาบโฟกัสจะไม่ถูกตื่นเต้น ทำให้แสงกระตุ้นส่องไปถึงระนาบโฟกัสได้มากขึ้น ทำให้แสงกระตุ้นทะลุชิ้นงานได้ลึกลงไป
3) แสงอินฟราเรดใกล้ความยาวคลื่นยาวเป็นพิษต่อเซลล์น้อยกว่าแสงความยาวคลื่นสั้น
4) เมื่อสังเกตตัวอย่างโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอน การฟอกสีด้วยแสงและความเป็นพิษต่อแสงจะเกิดขึ้นบนระนาบโฟกัสเท่านั้น ดังนั้น กล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอนจึงเหมาะสมกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบโฟตอนเดี่ยวสำหรับการสังเกตตัวอย่างที่มีความหนา สำหรับการสังเกตเซลล์ที่มีชีวิต หรือสำหรับการทดลองการฟอกสีด้วยแสงแบบจุดคงที่
ความรู้เกี่ยวกับกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์คอนโฟคอล
หลักการพื้นฐานของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบคอนโฟคอล: ใช้แหล่งกำเนิดแสงแบบจุดเพื่อให้แสงสว่างแก่ชิ้นงาน เพื่อสร้างจุดไฟขนาดเล็กที่มีความชัดเจนชัดเจนบนระนาบโฟกัส แสงฟลูออเรสเซนต์ที่ปล่อยออกมาจากจุดนั้นหลังจากถูกส่องสว่างจะถูกรวบรวมโดยเลนส์ใกล้วัตถุ และส่งคืนไปยังกระจกไดโครอิกตามเส้นทางแสงส่องสว่างดั้งเดิม เป็นตัวแยกลำแสง สเปกโตรมิเตอร์จะส่งแสงฟลูออเรสเซนต์ไปยังเครื่องตรวจจับโดยตรง มีรูเข็มอยู่ด้านหน้าแหล่งกำเนิดแสงและตัวตรวจจับ ซึ่งเรียกว่ารูเข็มส่องสว่างและรูเข็มตรวจจับตามลำดับ มิติทางเรขาคณิตของทั้งสองมีความสอดคล้องกัน ประมาณ 100-200 นาโนเมตร เมื่อเทียบกับจุดแสงบนระนาบโฟกัส ทั้งสองจุดเชื่อมต่อกัน กล่าวคือ จุดแสงผ่านเลนส์หลายชุด และท้ายที่สุดก็สามารถโฟกัสไปที่รูเข็มการส่องสว่างและรูเข็มตรวจจับในเวลาเดียวกันได้ ด้วยวิธีนี้ แสงจากระนาบโฟกัสจึงสามารถรวมตัวอยู่ภายในรูตรวจจับได้ ในขณะที่แสงที่กระเจิงจากด้านบนหรือด้านล่างระนาบโฟกัสจะถูกบังไว้ด้านนอกรูตรวจจับและไม่สามารถถ่ายภาพได้ ตัวอย่างจะถูกสแกนทีละจุดด้วยเลเซอร์ และหลอดโฟโตมัลติพลายเออร์ที่อยู่ด้านหลังรูเข็มตรวจจับยังได้รับภาพคอนโฟคอลของจุดแสงที่สอดคล้องกันทีละจุด ซึ่งจะถูกแปลงเป็นสัญญาณดิจิทัลและส่งไปยังคอมพิวเตอร์ และในที่สุดก็ถูกรวมเข้าด้วยกัน บนหน้าจอให้เป็นภาพคอนโฟคอลที่ชัดเจนของระนาบโฟกัสทั้งหมด -
ภาพระนาบโฟกัสแต่ละภาพจริงๆ แล้วเป็นภาพตัดขวางเชิงแสงของชิ้นงานทดสอบ ภาพตัดขวางเชิงแสงนี้มีความหนาที่แน่นอนเสมอ และเรียกอีกอย่างว่าหน้าตัดเชิงแสง เนื่องจากความเข้มของแสงที่จุดโฟกัสนั้นมากกว่าความเข้มของแสงที่จุดที่ไม่ใช่โฟกัสอย่างมาก และแสงระนาบที่ไม่ใช่โฟกัสจะถูกกรองโดยรูเข็ม ระยะชัดลึกของระบบคอนโฟคอลจึงอยู่ที่ประมาณศูนย์ การสแกนไปตามทิศทางของแกน Z สามารถรับรู้ถึงการตรวจเอกซเรย์ด้วยแสง ซึ่งสร้างส่วนที่ต้องการ สังเกตส่วนแสงสองมิติที่จุดที่โฟกัสของตัวอย่าง ด้วยการรวมการสแกนระนาบ XY (ระนาบโฟกัส) เข้ากับการสแกนแกน Z (แกนออปติคอล) โดยการสะสมระดับต่อเนื่องของภาพสองมิติและประมวลผลด้วยซอฟต์แวร์คอมพิวเตอร์เฉพาะทาง ทำให้ได้ภาพสามมิติของตัวอย่าง
นั่นคือรูเข็มตรวจจับและรูเข็มของแหล่งกำเนิดแสงจะโฟกัสที่จุดเดียวกันเสมอ ดังนั้นแสงฟลูออเรสเซนต์ที่ตื่นเต้นอยู่นอกระนาบโฟกัสจึงไม่สามารถเข้าไปในรูเข็มตรวจจับได้
หลักการทำงานของคอนโฟคอลเลเซอร์คือการใช้เลเซอร์เป็นแหล่งกำเนิดแสง บนพื้นฐานของการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบดั้งเดิม จะมีการเพิ่มอุปกรณ์สแกนด้วยเลเซอร์และอุปกรณ์โฟกัสแบบคอนจูเกต และระบบจะถูกควบคุมโดยคอมพิวเตอร์เพื่อรวบรวมและประมวลผลภาพดิจิทัล
