กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์มีสองประเภทในแง่ของเส้นทางแสง:
1. กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบส่องผ่าน: แหล่งกำเนิดแสงกระตุ้นใช้เพื่อกระตุ้นการเรืองแสงโดยการส่งผ่านวัสดุตัวอย่างผ่านเลนส์คอนเดนเซอร์ นอกจากนี้ยังสามารถใช้เครื่องสร้างความเข้มข้นของสนามมืดที่ใช้กันทั่วไปได้ และเครื่องสร้างความเข้มข้นแบบธรรมดาสามารถใช้เพื่อปรับตัวสะท้อนแสงเพื่อเปลี่ยนเส้นทางและแยกแสงกระตุ้นไปยังชิ้นงานทดสอบ นี่เป็นกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์-ที่ค่อนข้างเก่า ข้อดีของมันคือการเรืองแสงที่รุนแรงที่กำลังขยายต่ำ แต่ข้อเสียก็คือการเรืองแสงจะลดลงตามกำลังขยายที่เพิ่มขึ้น ดังนั้นจึงเป็นการดีกว่าสำหรับการสังเกตวัสดุตัวอย่างที่มีขนาดใหญ่กว่า
2. กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงแบบตกเป็นกล้องจุลทรรศน์ชนิดเรืองแสงชนิดใหม่ที่พัฒนาขึ้นในยุคปัจจุบัน ต่างจากที่กล่าวข้างต้น แสงกระตุ้นจะตกจากเลนส์ใกล้วัตถุลงสู่พื้นผิวของชิ้นงานทดสอบ โดยใช้เลนส์ใกล้วัตถุเดียวกันกับคอนเดนเซอร์ส่องสว่างและเลนส์ใกล้วัตถุเพื่อรวบรวมแสงเรืองแสง จำเป็นต้องเพิ่มตัวแยกลำแสงสีคู่ในเส้นทางแสง ซึ่งอยู่ห่างจากยูเรเนียมเบา 45 องศา มุม แสงกระตุ้นจะสะท้อนเข้าสู่เลนส์ใกล้วัตถุและเน้นไปที่ตัวอย่าง แสงฟลูออเรสเซนต์ที่สร้างโดยตัวอย่าง เช่นเดียวกับแสงกระตุ้นที่สะท้อนจากพื้นผิวของเลนส์ใกล้วัตถุและกระจกครอบ จะเข้าสู่เลนส์ใกล้วัตถุและกลับไปยังตัวแยกลำแสงสีคู่ เพื่อแยกแสงกระตุ้นและแสงฟลูออเรสเซนต์ จากนั้นแสงกระตุ้นที่ตกค้างจะถูกดูดซับโดยตัวกรองที่ปิดกั้น หากใช้ตัวกรองการกระตุ้น/ตัวแยกลำแสงสีคู่/ตัวกรองปิดกั้นที่แตกต่างกัน พวกมันจะสามารถตอบสนองความต้องการของผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาเรืองแสงที่แตกต่างกันได้ ข้อดีของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์นี้คือ การส่องสว่างในสนามที่สม่ำเสมอ การสร้างภาพที่ชัดเจน และการเรืองแสงที่เข้มขึ้นด้วยกำลังขยายที่มากขึ้น
