วิธีการสังเกตหลักของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงคือการสังเกตการเรืองแสง
การเรืองแสงหมายถึงกระบวนการที่สารเรืองแสงเปล่งแสงที่มีความยาวคลื่นยาวกว่าเกือบจะพร้อมๆ กัน เมื่อถูกฉายรังสีด้วยแสงที่มีความยาวคลื่นเฉพาะ (รูปที่ 1) เมื่อแสงที่มีความยาวคลื่นเฉพาะ (ความยาวคลื่นกระตุ้น) กระทบกับโมเลกุล เช่น แสงที่อยู่ในฟลูออโรฟอร์ พลังงานโฟตอนจะถูกดูดซับโดยอิเล็กตรอนของโมเลกุล ต่อไป อิเล็กตรอนจะเปลี่ยนจากสถานะพื้น (S0) ไปสู่ระดับพลังงานที่สูงขึ้น ซึ่งก็คือสถานะกระตุ้น (S1') กระบวนการนี้เรียกว่าการกระตุ้น① อิเล็กตรอนจะอยู่ในสถานะตื่นเต้นเป็นเวลา 10-9–10-8 วินาที ซึ่งในระหว่างนั้นอิเล็กตรอนจะสูญเสียพลังงานไป② ในระหว่างกระบวนการที่อิเล็กตรอนออกจากสถานะกระตุ้น (S1) และกลับสู่สถานะพื้น③ พลังงานที่เหลือซึ่งถูกดูดซับในระหว่างกระบวนการกระตุ้นจะถูกปลดปล่อยออกมา
เวลาที่อยู่อาศัยของโมเลกุลเรืองแสงในสถานะกระตุ้นคืออายุการใช้งานของการเรืองแสง ซึ่งโดยทั่วไปจะอยู่ที่ระดับนาโนวินาที และเป็นลักษณะโดยธรรมชาติของโมเลกุลเรืองแสงเอง การถ่ายภาพด้วยแสงตลอดอายุการใช้งาน (FLIM) ซึ่งใช้เทคโนโลยีการถ่ายภาพตลอดอายุการใช้งานของเรืองแสง เรียกว่า การถ่ายภาพตลอดชีพด้วยแสงเรืองแสง (FLIM) นอกเหนือจากการถ่ายภาพความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์แล้ว ยังสามารถรับการวัดเชิงลึกและการทำงานที่แม่นยำยิ่งขึ้นเพื่อให้ได้โครงสร้างโมเลกุล ปฏิสัมพันธ์ระหว่างโมเลกุล และสภาพแวดล้อมระดับจุลภาคของโมเลกุล ข้อมูลที่รับได้ยากด้วยการถ่ายภาพด้วยแสงแบบเดิม
คุณสมบัติที่สำคัญอีกประการหนึ่งของการเรืองแสงคือการเปลี่ยนแปลงของสโตกส์ ซึ่งเป็นความแตกต่างของความยาวคลื่นระหว่างจุดกระตุ้นและการปล่อยสูงสุด (ภาพที่ 2) โดยปกติแล้ว ความยาวคลื่นที่เปล่งออกมาจะยาวกว่าความยาวคลื่นที่กระตุ้น เนื่องจากอิเล็กตรอนจะสูญเสียพลังงานส่วนหนึ่งผ่านกระบวนการคลายตัวหลังจากที่สารเรืองแสงถูกกระตุ้นและก่อนที่จะปล่อยโฟตอน สารเรืองแสงที่มีการขยับของสโตกส์ขนาดใหญ่จะสังเกตได้ง่ายกว่าภายใต้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์
กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงและก้อนกรองเรืองแสง
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์เป็นกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงที่ใช้คุณสมบัติของการเรืองแสงสำหรับการสังเกตและการถ่ายภาพ และใช้กันอย่างแพร่หลายในสาขาต่างๆ เช่น ชีววิทยาของเซลล์ ชีววิทยาประสาท พฤกษศาสตร์ จุลชีววิทยา พยาธิวิทยา และพันธุศาสตร์ การถ่ายภาพด้วยแสงฟลูออเรสเซนต์มีข้อดีคือมีความไวสูงและความจำเพาะสูง และเหมาะมากสำหรับการสังเกตการกระจายของโปรตีนและออร์แกเนลล์เฉพาะในเนื้อเยื่อและเซลล์ การศึกษาการรวมศูนย์และการทำงานร่วมกัน การติดตามกระบวนการไดนามิกของสิ่งมีชีวิต เช่น การเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นของไอออน ฯลฯ
โมเลกุลส่วนใหญ่ในเซลล์ไม่เรืองแสง และเพื่อให้มองเห็นได้ จะต้องมีป้ายกำกับเรืองแสง การติดฉลากเรืองแสงมีหลายวิธี เช่น การติดฉลากโดยตรง (เช่น การใช้ DAPI เพื่อติดฉลาก DNA) หรือการทำให้ภูมิคุ้มกันบกพร่องโดยใช้คุณสมบัติการจับกับแอนติเจนของแอนติบอดี หรือการใช้โปรตีนเรืองแสง (เช่น GFP, โปรตีนเรืองแสงสีเขียว) เพื่อติดฉลากโปรตีนเป้าหมาย และการเข้าเล่มแบบพลิกกลับได้ สีสังเคราะห์ (เช่น Fura-2) และอื่นๆ
ในปัจจุบัน กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ได้กลายเป็นอุปกรณ์ถ่ายภาพมาตรฐานของห้องปฏิบัติการและแพลตฟอร์มการถ่ายภาพต่างๆ และเป็นผู้ช่วยที่ดีสำหรับการทดลองประจำวันของเรา กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนส์ส่วนใหญ่แบ่งออกเป็นสามประเภท: กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ตั้งตรง (เหมาะสำหรับการหั่น) กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์หัวกลับ (เหมาะสำหรับเซลล์ที่มีชีวิต โดยคำนึงถึงการแบ่งส่วน) กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ (เหมาะสำหรับตัวอย่างขนาดใหญ่ เช่น พืช ปลาม้าลาย (ตัวเต็มวัย/ตัวอ่อน) ) , medaka อวัยวะของหนู/หนู เป็นต้น)
บล็อกฟิลเตอร์เรืองแสงเป็นส่วนประกอบหลักของการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ ประกอบด้วยสามส่วน: ตัวกรองการกระตุ้น ตัวกรองการปล่อย และตัวแยกลำแสงไดโครอิก มันถูกติดตั้งในล้อกรอง ตัวอย่างเช่น Leica DMi8 มาพร้อมกับ 6-วงล้อตัวกรองตำแหน่ง (รูปที่ 3 ) จำนวนตำแหน่งของวงล้อไมโครสโคปต่างๆ จะแตกต่างกัน และไมโครสโคปบางตัวใช้แถบเลื่อนตัวกรอง
บล็อกตัวกรองมีบทบาทสำคัญในการสร้างภาพเรืองแสง: ตัวกรองกระตุ้นจะเลือกแสงกระตุ้นเพื่อกระตุ้นตัวอย่าง และบล็อกแสงของความยาวคลื่นอื่นๆ แสงที่ผ่านฟิลเตอร์กระตุ้นจะผ่านกระจกไดโครอิก (หน้าที่ของมันคือการสะท้อนแสงกระตุ้นและส่งฟลูออเรสเซนซ์) หลังจากการสะท้อน แสงจะถูกโฟกัสโดยเลนส์ใกล้วัตถุ ฉายรังสีตัวอย่าง และกระตุ้นการเรืองแสงที่สอดคล้องกัน นั่นคือ , เปล่งแสง. แสงที่ปล่อยออกมาจะถูกรวบรวมโดยเลนส์ใกล้วัตถุ ผ่านตัวแยกลำแสงไดโครอิก และไปถึงตัวกรองการแผ่รังสี ดังแสดงในรูปที่ 4: ความยาวคลื่นกระตุ้นคือ 450-490นาโนเมตร กระจกไดโครอิกสะท้อนแสงสั้นกว่า 510 นาโนเมตร ส่งผ่านแสงยาวกว่า 510 นาโนเมตร และช่วงรับแสงที่ปล่อยออกมาคือ 520-560นาโนเมตร
