ความแตกต่างระหว่างกล้องจุลทรรศน์ธรรมดาและกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ใช้แสงอัลตราไวโอเลตเป็นแหล่งกำเนิดแสงเพื่อฉายรังสีวัตถุที่จะตรวจสอบ เพื่อให้วัตถุเปล่งแสง จากนั้นสังเกตวัตถุภายใต้กล้องจุลทรรศน์ ส่วนใหญ่ใช้สำหรับเซลล์อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ โดยส่วนใหญ่ประกอบด้วยแหล่งกำเนิดแสง ระบบแผ่นกรอง และระบบออปติกเพื่อสังเกตภาพเรืองแสงของตัวอย่างผ่านการขยายของเลนส์ใกล้ตาและเลนส์ใกล้วัตถุ มาดูความแตกต่างระหว่างกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์กับกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงธรรมดากัน
1. ในแง่ของวิธีการจัดแสง
วิธีการส่องสว่างของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์โดยทั่วไปเป็นแบบ episcopic กล่าวคือ ฉายแหล่งกำเนิดแสงบนตัวอย่างทดสอบผ่านเลนส์ใกล้วัตถุ
2. ในแง่ของความละเอียด
กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงใช้แสงอัลตราไวโอเลตเป็นแหล่งกำเนิดแสง ความยาวคลื่นค่อนข้างสั้นแต่มีความละเอียดสูงกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงทั่วไป
3. ความแตกต่างของตัวกรอง
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ใช้ฟิลเตอร์พิเศษ 2 ชิ้น ซึ่งใช้ด้านหน้าแหล่งกำเนิดแสงเพื่อกรองแสงที่มองเห็น และใช้ระหว่างเลนส์ใกล้วัตถุกับเลนส์ใกล้ตาเพื่อกรองแสงอัลตราไวโอเลต ซึ่งสามารถปกป้องดวงตาของมนุษย์ได้
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์เป็นกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงชนิดหนึ่ง ส่วนใหญ่เป็นเพราะความยาวคลื่นที่ตื่นเต้นด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงนั้นสั้น ดังนั้นสิ่งนี้จึงนำไปสู่ความแตกต่างในโครงสร้างและการใช้งานระหว่างกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงและกล้องจุลทรรศน์ธรรมดา กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ส่วนใหญ่มีฟังก์ชั่นที่ดีในการจับแสงที่อ่อน ดังนั้นภายใต้การเรืองแสงที่อ่อนมาก ความสามารถในการถ่ายภาพของมันก็ดีเช่นกัน เมื่อรวมกับการปรับปรุงอย่างต่อเนื่องของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา สัญญาณรบกวนก็ลดลงอย่างมากเช่นกัน จึงมีการใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงมากขึ้นเรื่อยๆ
ความรู้เกี่ยวกับกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบสองโฟตอน
หลักการพื้นฐานของการกระตุ้นสองโฟตอนคือ: ในกรณีของโฟตอนที่มีความหนาแน่นสูง โมเลกุลของฟลูออเรสเซนต์สามารถดูดซับโฟตอนที่มีความยาวคลื่นยาวสองตัวได้ในเวลาเดียวกัน และปล่อยโฟตอนที่มีความยาวคลื่นสั้นกว่าหลังจากช่วงเวลาสั้น ๆ ของสิ่งที่เรียกว่าสถานะกระตุ้น . ; ผลจะเหมือนกับการใช้โฟตอนที่มีความยาวคลื่นครึ่งหนึ่งของความยาวคลื่นยาวเพื่อกระตุ้นโมเลกุลเรืองแสง การกระตุ้นโฟตอนแบบสองต้องการความหนาแน่นของโฟตอนสูง เพื่อไม่ให้เซลล์เสียหาย กล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอนใช้เลเซอร์พัลซิ่งแบบล็อกโหมดพลังงานสูง เลเซอร์ที่ปล่อยออกมาจากเลเซอร์นี้มีพลังงานสูงสุดสูงและพลังงานเฉลี่ยต่ำ ความกว้างพัลส์ของมันอยู่ที่ 100 เฟมโตวินาทีเท่านั้น และความถี่ของมันสามารถสูงถึง 80 ถึง 100 เมกะเฮิรตซ์ เมื่อใช้เลนส์ใกล้วัตถุที่มีรูรับแสงเป็นตัวเลขสูงเพื่อโฟกัสโฟตอนของเลเซอร์พัลซิ่ง ความหนาแน่นของโฟตอนที่จุดโฟกัสของเลนส์ใกล้วัตถุจะสูงที่สุด และการกระตุ้นโฟตอนแบบสองโฟตอนจะเกิดขึ้นที่จุดโฟกัสของเลนส์ใกล้วัตถุเท่านั้น ดังนั้น กล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอนไม่จำเป็นต้องมีรูเข็มแบบคอนโฟคอล ซึ่งช่วยปรับปรุงประสิทธิภาพการตรวจจับฟลูออเรสเซนต์
ในปรากฏการณ์การเรืองแสงทั่วไป เนื่องจากความหนาแน่นของโฟตอนที่ต่ำของแสงกระตุ้น โมเลกุลของฟลูออเรสเซนต์สามารถดูดซับโฟตอนได้เพียงหนึ่งตัวในเวลาเดียวกัน จากนั้นจึงปล่อยโฟตอนที่เรืองแสงผ่านการเปลี่ยนผ่านแบบแผ่รังสี ซึ่งเป็นการเรืองแสงโฟตอนเดี่ยว สำหรับกระบวนการกระตุ้นการเรืองแสงโดยใช้เลเซอร์เป็นแหล่งกำเนิดแสง อาจเกิดการเรืองแสงแบบสองโฟตอนหรือหลายโฟตอนได้ ในเวลานี้ ความเข้มของแหล่งกำเนิดแสงกระตุ้นที่ใช้อยู่ในระดับสูง และความหนาแน่นของโฟตอนเป็นไปตามข้อกำหนดของโมเลกุลเรืองแสงที่ดูดซับโฟตอนสองตัวในเวลาเดียวกัน ในกระบวนการใช้เลเซอร์ทั่วไปเป็นแหล่งกำเนิดแสงกระตุ้น ความหนาแน่นของโฟตอนยังไม่เพียงพอที่จะทำให้เกิดปรากฏการณ์การดูดกลืนโฟตอนแบบสองแสง โดยปกติแล้วจะใช้เลเซอร์พัลซิ่งเฟมโตวินาที และพลังงานทันทีของมันสามารถเข้าถึงคำสั่งของเมกะวัตต์ ดังนั้น ความยาวคลื่นของการเรืองแสงแบบสองโฟตอนจึงสั้นกว่าความยาวคลื่นของแสงกระตุ้น ซึ่งเทียบเท่ากับผลที่เกิดจากการกระตุ้นที่ครึ่งหนึ่งของความยาวคลื่นกระตุ้น
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบสองโฟตอนมีข้อดีหลายประการ:
1) แสงที่มีความยาวคลื่นยาวได้รับผลกระทบจากการกระเจิงน้อยกว่าแสงที่มีความยาวคลื่นสั้น และทะลุผ่านชิ้นงานทดสอบได้ง่าย
2) โมเลกุลเรืองแสงที่อยู่นอกระนาบโฟกัสจะไม่ถูกกระตุ้น เพื่อให้แสงกระตุ้นสามารถเข้าถึงระนาบโฟกัสได้มากขึ้น เพื่อให้แสงกระตุ้นสามารถทะลุผ่านตัวอย่างที่ลึกขึ้นได้
3) แสงอินฟราเรดใกล้ความยาวคลื่นยาวมีความเป็นพิษต่อเซลล์น้อยกว่าแสงความยาวคลื่นสั้น
4) เมื่อใช้กล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอนเพื่อสังเกตตัวอย่าง การฟอกสีด้วยแสงและความเป็นพิษต่อแสงจะเกิดขึ้นเฉพาะในระนาบโฟกัสเท่านั้น ดังนั้น กล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอนจึงเหมาะสมกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบโฟตอนเดียวสำหรับการสังเกตชิ้นงานที่มีความหนา สำหรับการสังเกตเซลล์ที่มีชีวิต หรือสำหรับการทดลองการฟอกสีด้วยแสงเฉพาะจุด
ความรู้เกี่ยวกับกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์คอนโฟคอล
หลักการพื้นฐานของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์คอนโฟคอล: แหล่งกำเนิดแสงแบบจุดถูกใช้เพื่อฉายรังสีชิ้นงาน และจุดแสงขนาดเล็กที่กำหนดไว้อย่างดีจะเกิดขึ้นบนระนาบโฟกัส ประกอบด้วยตัวแยก ตัวแยกลำแสงจะส่งสารเรืองแสงไปยังเครื่องตรวจจับโดยตรง มีรูเข็มอยู่ด้านหน้าของแหล่งกำเนิดแสงและตัวตรวจจับ ซึ่งเรียกว่ารูเข็มส่องสว่างและรูเข็มตรวจจับตามลำดับ ขนาดทางเรขาคณิตของทั้งสองเท่ากัน คือประมาณ 100-200nm; เมื่อเทียบกับจุดแสงบนระนาบโฟกัส ทั้งสองจะเชื่อมต่อกัน กล่าวคือ จุดแสงจะผ่านชุดเลนส์ และสุดท้ายสามารถโฟกัสไปที่รูเข็มส่องสว่างและรูเข็มตรวจจับได้พร้อมกัน ด้วยวิธีนี้ แสงจากระนาบโฟกัสสามารถรวมกันอยู่ภายในขอบเขตของรูตรวจจับ ในขณะที่แสงที่กระจัดกระจายจากด้านบนหรือด้านล่างของระนาบโฟกัสจะถูกบังไว้นอกรูตรวจจับและไม่สามารถถ่ายภาพได้ เลเซอร์จะสแกนตัวอย่างทีละจุด และหลอดโฟโตมัลติพลายเออร์หลังจากตรวจพบรูเข็มแล้ว ยังได้รับภาพคอนโฟคอลของจุดแสงที่สอดคล้องกันทีละจุด ซึ่งจะถูกแปลงเป็นสัญญาณดิจิทัลและส่งไปยังคอมพิวเตอร์ และสุดท้ายจะรวมเข้าด้วยกันเป็นที่ชัดเจน ภาพคอนโฟคอลของระนาบโฟกัสทั้งหมดบนหน้าจอ
ภาพระนาบโฟกัสแต่ละภาพเป็นภาพตัดขวางของชิ้นงาน ส่วนตัดขวางเชิงแสงนี้จะมีความหนาที่แน่นอนเสมอ หรือที่เรียกว่าส่วนบางเชิงแสง เนื่องจากความเข้มของแสงที่จุดโฟกัสจะมากกว่าที่จุดที่ไม่ได้โฟกัสมาก และแสงระนาบที่ไม่โฟกัสจะถูกกรองโดยรูเข็ม ระยะชัดลึกของระบบคอนโฟคอลจึงอยู่ที่ประมาณศูนย์ และการสแกนตามแนว Z - แกนสามารถรับการตรวจเอกซเรย์ด้วยแสงโดยสร้างส่วนออปติคอลสองมิติที่จุดโฟกัสของตัวอย่าง เมื่อรวมการสแกนระนาบ XY (ระนาบโฟกัส) เข้ากับการสแกนแกน Z (แกนออปติคัล) จะได้ภาพสามมิติของตัวอย่างโดยการรวบรวมภาพสองมิติของเลเยอร์ต่อเนื่องและประมวลผลด้วยซอฟต์แวร์คอมพิวเตอร์พิเศษ
นั่นคือ รูเข็มตรวจจับและรูเข็มแหล่งกำเนิดแสงจะโฟกัสที่จุดเดียวกันเสมอ ดังนั้นสารเรืองแสงที่กระตุ้นภายนอกระนาบโฟกัสจึงไม่สามารถเข้าไปในรูเข็มตรวจจับได้
การแสดงออกอย่างง่ายของหลักการทำงานของเลเซอร์คอนโฟคอลคือใช้เลเซอร์เป็นแหล่งกำเนิดแสง และบนพื้นฐานของการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบดั้งเดิม เพิ่มอุปกรณ์การสแกนด้วยเลเซอร์และอุปกรณ์โฟกัสแบบคอนจูเกต และเป็นระบบสำหรับการรับภาพดิจิทัลและ ประมวลผลผ่านการควบคุมด้วยคอมพิวเตอร์
