ความแตกต่างและลักษณะเฉพาะระหว่างกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์และกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงธรรมดา
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แตกต่างจากกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงทั่วไป มันไม่ได้สังเกตชิ้นงานผ่านการส่องสว่างของแหล่งกำเนิดแสงธรรมดา แต่จะใช้แสงที่มีความยาวคลื่นตามที่กำหนด (โดยปกติคือแสงอัลตราไวโอเลต แสงสีน้ำเงิน-ม่วง) เพื่อกระตุ้นวัสดุฟลูออเรสเซนต์ในชิ้นงานทดสอบใต้กล้องจุลทรรศน์ ทำให้เกิดการเปล่งแสงเรืองแสง ดังนั้น แหล่งกำเนิดแสงของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์จึงไม่ทำหน้าที่เป็นการส่องสว่างโดยตรง แต่เป็นแหล่งพลังงานที่กระตุ้นวัสดุเรืองแสงภายในของชิ้นงานทดสอบ เหตุผลที่เราสามารถสังเกตเห็นชิ้นงานทดสอบไม่ได้เกิดจากการส่องสว่างของแหล่งกำเนิดแสง แต่เป็นปรากฏการณ์เรืองแสงที่เกิดจากวัสดุเรืองแสงในชิ้นงานที่ดูดซับพลังงานแสงที่ตื่นเต้น จะเห็นได้ว่าลักษณะสำคัญของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์คือแหล่งกำเนิดแสงสามารถจ่ายแสงกระตุ้นจำนวนมากในช่วงความยาวคลื่นเฉพาะ เพื่อให้สารเรืองแสงในชิ้นงานที่ทดสอบสามารถรับความเข้มของแสงกระตุ้นที่จำเป็นได้ ในเวลาเดียวกัน กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์จะต้องมีระบบกรองที่สอดคล้องกัน กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์เป็นเครื่องมือสำคัญสำหรับฮิสโตเคมีเรืองแสงขั้นสูง ประกอบด้วยแหล่งกำเนิดแสงแรงดันสูงพิเศษ ระบบฟิลเตอร์ (รวมถึงแผ่นกรองการกระตุ้นและปราบปราม) ระบบออพติคอล และระบบการถ่ายภาพ โดยจะใช้แสงที่มีความยาวคลื่นจำนวนหนึ่งเพื่อกระตุ้นชิ้นงานให้เปล่งแสงเรืองแสง
1. วิธีกระตุ้นแสงฟลูออเรสเซนต์: ตามช่วงความยาวคลื่นของแสง แบ่งออกเป็น 2 ประเภทคือ วิธีกระตุ้นด้วยรังสียูวี (โดยใช้วิธีให้แสงอัลตราไวโอเลต) และวิธีกระตุ้น BV (ใช้แสงสีน้ำเงิน-ม่วง) วิธีการกระตุ้นด้วยรังสียูวีใช้แสงอัลตราไวโอเลตใกล้ที่สั้นกว่า 400 นาโนเมตรในการกระตุ้น วิธีนี้ไม่มีแสงกระตุ้นที่มองเห็นได้ ดังนั้นการเรืองแสงที่สังเกตได้จะแสดงการเรืองแสงโดยธรรมชาติของสีย้อม ทำให้ง่ายต่อการแยกแยะการเรืองแสงจำเพาะบนชิ้นงานทดสอบจากการเรืองแสงอัตโนมัติของเนื้อเยื่อพื้นหลัง
2. วิธีการกระตุ้น BV: การกระตุ้นจากรังสีอัลตราไวโอเลตไปจนถึงแสงสีน้ำเงินที่มีศูนย์กลางอยู่ที่ 404 นาโนเมตรและ 434 นาโนเมตร วิธีนี้ใช้แสงสีน้ำเงินในการส่องสว่างชิ้นงาน ดังนั้นตัวกรองแบบตัดของระบบสังเกตการณ์ฟลูออเรสเซนซ์ต้องใช้ตัวกรองที่สามารถปิดกั้นแสงสีน้ำเงินได้อย่างสมบูรณ์และผ่านการเรืองแสงสีเขียวและสีเหลืองที่ต้องการได้เต็มที่ สีย้อมฟลูออเรสเซนต์ที่ใช้ในวิธีฟลูออเรสเซนต์แอนติบอดี ความยาวคลื่นดูดกลืนแสงสูงสุดของแสงกระตุ้นและความยาวคลื่นการปล่อยแสงสูงสุดของฟลูออเรสเซนต์ค่อนข้างใกล้เคียงกัน ดังนั้นตัวกรองที่ใช้ในวิธีการกระตุ้น BV จะต้องใช้ตัวกรองจุดตัดแบบคม วิธีนี้สามารถใช้แสงสีน้ำเงินเป็นแสงกระตุ้นได้ ดังนั้นประสิทธิภาพการดูดซับของเม็ดสีฟลูออเรสเซนต์จะสูงกว่าและได้ภาพที่สว่างกว่า ข้อเสียคือไม่สามารถมองเห็นแสงเรืองแสงที่ต่ำกว่า 500 นาโนเมตรได้ ในขณะที่แสงเรืองแสงที่สูงกว่า 500 นาโนเมตรจะทำให้ภาพทั้งหมดปรากฏเป็นสีเหลือง ในวิธีฟลูออเรสเซนต์แอนติบอดี ความจำเพาะของสีย้อมฟลูออเรสเซนต์ส่วนใหญ่จะตัดสินจากสีที่เป็นเอกลักษณ์ของมัน ดังนั้น เมื่อพูดถึงความจำเพาะที่ละเอียดอ่อน ข้อบกพร่องที่กล่าวมาข้างต้นของวิธีการกระตุ้น BV มักจะส่งผลกระทบอย่างมาก
