การนับจุลินทรีย์โดยตรงด้วยกล้องจุลทรรศน์

การนับจุลินทรีย์โดยตรงด้วยกล้องจุลทรรศน์

หลักการทดลอง
การนับโดยตรงภายใต้กล้องจุลทรรศน์โดยใช้เครื่องวัดเม็ดเลือดเป็นวิธีการนับจำนวนจุลินทรีย์ที่ใช้กันทั่วไป ข้อดีของวิธีนี้คือใช้งานง่ายและรวดเร็ว วางสารแขวนลอยแบคทีเรียที่เจือจางอย่างเหมาะสม (หรือสารแขวนลอยสปอร์) ในห้องนับระหว่างสไลด์กับกระจกฝาครอบของฮีโมไซโตมิเตอร์ และนับภายใต้กล้องจุลทรรศน์ เนื่องจากปริมาตรของห้องนับคงที่ (0.1 มม.2) จึงสามารถแปลงเป็นจำนวนจุลินทรีย์ทั้งหมดต่อหน่วยปริมาตรตามจำนวนจุลินทรีย์ที่สังเกตได้ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ เนื่องจากวิธีนี้นับผลรวมของแบคทีเรียที่มีชีวิตและแบคทีเรียที่ตายแล้ว จึงเรียกว่าวิธีการนับแบคทีเรียทั้งหมด

โดยปกติเครื่องวัดเม็ดเลือดจะเป็นสไลด์แก้วพิเศษซึ่งมีร่องสี่ร่องประกอบเป็นสามแท่น แท่นตรงกลางแบ่งออกเป็นสองซีกโดยมีร่องสั้นตามแนวนอน มีการสลักตารางไว้บนแท่นแต่ละด้าน แต่ละตารางจะแบ่งออกเป็นสี่เหลี่ยมขนาดใหญ่เก้าช่อง จัตุรัสใหญ่ตรงกลางเป็นห้องนับ จุลินทรีย์จะถูกนับในห้องนับ โครงสร้างของแผงนับเม็ดเลือดแสดงไว้ในรูปที่ Ⅷ-1

ขนาดของห้องนับโดยทั่วไปมีข้อกำหนดสองประการ ประการแรกคือสี่เหลี่ยมขนาดใหญ่แบ่งออกเป็นสี่เหลี่ยมตรงกลาง 16 ช่อง และสี่เหลี่ยมตรงกลางแต่ละอันแบ่งออกเป็นสี่เหลี่ยมเล็กๆ 25 ช่อง (รูปที่ Ⅷ-2) อีกอันเป็นสี่เหลี่ยมจัตุรัสขนาดใหญ่ สี่เหลี่ยมจัตุรัสแบ่งออกเป็นสี่เหลี่ยมตรงกลาง 25 ช่อง และสี่เหลี่ยมตรงกลางแต่ละช่องแบ่งออกเป็นสี่เหลี่ยมเล็กๆ 16 ช่อง (รูปที่ Ⅷ-1, C) แต่ไม่ว่าบอร์ดนับจะเป็นแบบใด จำนวนสี่เหลี่ยมเล็กๆ ในแต่ละสี่เหลี่ยมใหญ่จะเท่ากัน นั่นคือ 16×25=400 สี่เหลี่ยมเล็กๆ ดังแสดงในรูป Ⅷ-2

ความยาวด้านของสี่เหลี่ยมขนาดใหญ่แต่ละอันคือ 1 มม. และพื้นที่ของสี่เหลี่ยมขนาดใหญ่แต่ละอันคือ 1 มม.2 หลังจากปิดฝาครอบกระจกแล้ว ความสูงระหว่างกระจกสไลด์และกระจกปิดคือ 0.1 มม. ดังนั้นปริมาตรของห้องนับคือ 0.1 มม.3

เมื่อทำการนับ โดยปกติจะนับจำนวนแบคทีเรียทั้งหมดในตารางตรงกลาง 5 ช่อง จากนั้นหาค่าเฉลี่ยของแต่ละตารางกลาง แล้วคูณด้วย 16 หรือ 25 เพื่อให้ได้จำนวนแบคทีเรียทั้งหมดในตารางขนาดใหญ่ แล้วแปลงเป็น จำนวนแบคทีเรียทั้งหมดในสารละลายแบคทีเรีย 1 มล.

อุปกรณ์ห้องปฏิบัติการ
เครื่องวัดเม็ดเลือด, กล้องจุลทรรศน์, แผ่นปิด, เส้นเลือดฝอยฆ่าเชื้อ;

วัสดุทดลอง
สารแขวนลอย Saccharomyces cerevisiae

ขั้นตอนการทดลอง (วิธีการนับโดยตรงด้วยกล้องจุลทรรศน์จุลินทรีย์)
1. การเจือจาง
เจือจางสารแขวนลอย Saccharomyces cerevisiae อย่างเหมาะสม ถ้าสารละลายแบคทีเรียไม่ข้นก็ไม่จำเป็นต้องเจือจาง
 

2. ห้องนับด้วยกล้องจุลทรรศน์
ก่อนที่จะเพิ่มตัวอย่าง ให้ทำการตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์ของห้องนับจำนวนบนแผ่นนับจำนวน หากมีสิ่งสกปรกต้องทำความสะอาดก่อนนับ
 

3. เพิ่มตัวอย่าง
ปิดแผ่นฮีโมไซโตมิเตอร์ที่สะอาดและแห้งด้วยกระจกปิด จากนั้นใช้หยดปากละเอียดที่ปราศจากเชื้อเพื่อหยดสารละลาย Saccharomyces cerevisiae ที่เจือจางเล็กน้อยจากขอบกระจกฝาครอบ (ไม่มากเกินไป) เพื่อให้สารละลายแบคทีเรีย อยู่ใกล้กับช่องว่างตามช่องว่าง ออสโมซิสของเส้นเลือดฝอยจะเข้าสู่ห้องนับด้วยตัวเอง และห้องนับทั่วไปสามารถเติมของเหลวจากแบคทีเรียได้ ระวังอย่าให้มีฟองอากาศ
 

4. การนับกล้องจุลทรรศน์
หลังจากพักเป็นเวลา 5 นาที ให้วางฮีโมไซโตมิเตอร์ไว้บนเวทีของกล้องจุลทรรศน์ ขั้นแรกให้ใช้เลนส์กำลังต่ำเพื่อค้นหาตำแหน่งของห้องนับ จากนั้นจึงเปลี่ยนไปใช้เลนส์กำลังสูงสำหรับการนับ หากพบว่าสารละลายแบคทีเรียหนาหรือบางเกินไปจึงจะนับได้ จำเป็นต้องปรับการเจือจางใหม่ก่อนนับ โดยทั่วไป การเจือจางตัวอย่างต้องใช้แบคทีเรียประมาณ 5-10 ในแต่ละเซลล์ ห้องนับแต่ละห้องจะเลือกแบคทีเรียในกริดกลาง 5 ช่อง (4 มุมเสริมและกริดกลาง) สำหรับการนับ โดยทั่วไปแบคทีเรียบนเส้นตารางจะนับเฉพาะเส้นบนและเส้นขวาเท่านั้น ในกรณีที่ยีสต์แตกหน่อ เมื่อขนาดตัวหน่อถึงครึ่งหนึ่งของเซลล์แม่ ให้นับแบคทีเรีย 2 ตัว นับตัวอย่างเพื่อคำนวณปริมาณแบคทีเรียของตัวอย่างจากค่าที่นับได้ในห้องนับจำนวน 2 ห้อง
 

5. การทำความสะอาดฮีโมไซโตมิเตอร์
หลังการใช้งาน ล้างแผ่นนับเม็ดเลือดบนก๊อกน้ำด้วยน้ำฉีด ห้ามล้างด้วยวัตถุแข็ง และเช็ดให้แห้งด้วยตัวเองหรือใช้เครื่องเป่าผมหลังล้าง การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ สังเกตว่ามีแบคทีเรียหรือตะกอนอื่นๆ หลงเหลืออยู่ในแต่ละเซลล์หรือไม่ ถ้าไม่สะอาดต้องล้างซ้ำๆจนกว่าจะสะอาด