คุณสมบัติและการประยุกต์ใช้กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์คอนโฟคอล
กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลสแกนด้วยเลเซอร์ (LSCM) เป็นกล้องจุลทรรศน์ชนิดหนึ่งที่ออกแบบโดยใช้เทคโนโลยีโฟกัสแบบคอนจูเกต กล่าวคือ เพื่อทำให้แหล่งกำเนิดแสงเลเซอร์ ตัวอย่างที่ทดสอบ และตัวตรวจจับทั้งหมดอยู่ในตำแหน่งคอนจูเกตของกันและกัน
พื้นฐาน
ในกล้องจุลทรรศน์ทั่วไป ระนาบโฟกัสของเลนส์ใกล้วัตถุตรงกับตัวตรวจจับ เพื่อให้ระนาบภาพที่สังเกตได้แยกออกจากระนาบแกนที่อยู่ติดกัน ในขณะที่ในกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล ตัวอย่างจะสว่างขึ้นโดยใช้จุดแสงที่จำกัดการเลี้ยวเบน และใน เอฟเฟ็กต์การแยกส่วนนี้ทำได้โดยใช้รูเข็มในเส้นทางแสงรวมที่จุดโฟกัสของคอนจูเกตแบบจุดเพื่อกรองแสงที่เล็ดลอดออกไปเพื่อปรับปรุงความละเอียด
คุณสมบัติการถ่ายภาพ
เฉพาะแสงที่สะท้อนกลับจากเลเยอร์ตัวอย่างที่เชื่อมต่อกันเท่านั้นที่สามารถผ่านรูเล็กๆ ในเส้นทางแสงของคอลเลกชันได้ และการสะท้อนแสงของชั้นตัวอย่างที่ไม่เกี่ยวข้องที่เหลือจะถูกปิดกั้นโดยรูเล็กๆ ซึ่งอาจส่งผลให้มีความละเอียดเพิ่มขึ้นอย่างมาก แสดงด้านล่างเป็นการเปรียบเทียบแบบเคียงข้างกันของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์หลายมิติและกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลของตัวอย่างที่มีความหนาเท่ากัน เมื่อถ่ายภาพเป็นชุดที่ระนาบโฟกัสที่แตกต่างกัน สามารถสร้างสิ่งที่เรียกว่า "z-stack" ได้ และภาพนี้แสดงทั้งความละเอียดและความเปรียบต่างที่เพิ่มขึ้นจากกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล และสาเหตุเบื้องหลังของการเพิ่มเหล่านี้ การตรวจสอบภาพที่ด้านบนของสแต็คด้วยระนาบภาพเหนือเนื้อเยื่อ เผยให้เห็นแสงกระจัดกระจายจำนวนมากในภาพเรืองแสง ในขณะที่ภาพคอนโฟคอลปรากฏเป็นสีดำ การลดลงของ PSF ในทิศทางตามแนวแกนมีส่วนรับผิดชอบโดยตรงต่อความแตกต่างของความละเอียดที่สังเกตได้ที่อินเทอร์เฟซออปติคัลที่อยู่ตรงกลางของ z-stack
คุณสมบัติอีกประการหนึ่งของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลสแกนด้วยเลเซอร์คือเป็นเทคโนโลยีการถ่ายภาพแบบสแกน เทคโนโลยีการส่องสว่างแบบขอบเขตกว้างแบบดั้งเดิมจะส่องสว่างทั่วทั้งตัวอย่าง จึงสามารถจับภาพได้โดยตรงด้วยตาเปล่าหรือเครื่องตรวจจับ แต่ LSCM ใช้ลำแสงหรือลำแสงที่โฟกัสหลายลำผ่านตัวอย่างสำหรับการสแกนและการสร้างภาพ และภาพที่ได้คือ เรียกว่าส่วนแสง ข้อมูลต่อไปนี้แสดงความแตกต่างระหว่างวิธีการส่องสว่างแบบมุมกว้างแบบดั้งเดิมกับวิธีการส่องสว่างแบบ Confocal แบบการสแกนด้วยเลเซอร์
ดังนั้น วิธีการทำงานเชิงปฏิบัติของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลสมัยใหม่แสดงไว้ในภาพด้านล่าง แสงกระตุ้นที่ปล่อยออกมาจากเลเซอร์จะผ่านกระจกไดโครอิกและสแกนในทิศทาง x และ y ของตัวอย่างผ่านกระจกสั่นคู่หนึ่ง การกระตุ้น (หรือการสะท้อน) ของตัวอย่าง แสงเข้าสู่เครื่องตรวจจับ PMT ผ่านรูเข็มและถูกบันทึก และภาพสแกนที่บันทึกไว้จะถูกสร้างขึ้นใหม่โดยคอมพิวเตอร์เพื่อให้ได้ภาพตัวอย่างจริง
