วิธีการเลือกกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงที่เหมาะสม
กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงเป็นอุปกรณ์ถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์มาตรฐานสำหรับห้องปฏิบัติการและแผนกพยาธิวิทยา ใช้คุณสมบัติการเรืองแสงสำหรับการสังเกตและการถ่ายภาพ มีการใช้กันอย่างแพร่หลายในเซลล์ชีววิทยา, ชีววิทยาประสาท, พฤกษศาสตร์, จุลชีววิทยา, พยาธิวิทยา, พันธุศาสตร์และสาขาอื่นๆ การถ่ายภาพด้วยแสงฟลูออเรสเซนต์มีข้อดีคือมีความไวสูงและความจำเพาะสูง และเหมาะมากสำหรับการสังเกตการกระจายของโปรตีนและออร์แกเนลล์เฉพาะในเนื้อเยื่อและเซลล์ การศึกษาการรวมศูนย์และการทำงานร่วมกัน การติดตามกระบวนการไดนามิกของสิ่งมีชีวิต เช่น การเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นของไอออน ฯลฯ
การเลือกกล้องจุลทรรศน์
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ส่วนใหญ่แบ่งออกเป็นสามประเภท: กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ตั้งตรง (เหมาะสำหรับการแบ่งส่วน) กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์หัวกลับ (เหมาะสำหรับเซลล์ที่มีชีวิต โดยคำนึงถึงการแบ่งส่วน) กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์สามมิติ (เหมาะสำหรับตัวอย่างขนาดใหญ่ เช่น พืช ปลาม้าลาย (ผู้ใหญ่/ เอ็มบริโอ) , เมดากะ อวัยวะของหนู/หนู เป็นต้น)
การเลือกก้อนกรองเรืองแสง
นอกเหนือจากการพิจารณาความยาวคลื่นของการกระตุ้นและการปล่อยของโพรบเรืองแสงแล้ว การเลือกบล็อกตัวกรองยังต้องพิจารณาว่ามีการกระตุ้นที่ไม่เฉพาะเจาะจงและการผสมข้ามสีสำหรับตัวอย่างที่มีฉลากหลายสีหรือไม่ ในการทดลอง เราจะพยายามเลือกความยาวคลื่นที่ใกล้เคียงที่สุดกับจุดสูงสุดของการกระตุ้นสำหรับการกระตุ้น และช่วงที่ได้รับจะต้องรวมจุดสูงสุดของการปล่อย ตัวอย่างเช่น จุดสูงสุดของการกระตุ้นของ Alexa Fluor 488 คือ 500 นาโนเมตร และสามารถเลือกตัวกรองการกระตุ้น 480/40 ในกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงได้ ลูกบาศก์ฟิลเตอร์เรืองแสงที่ใช้กันทั่วไปในกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์สามารถแบ่งออกได้เป็นสองประเภท: แบบยาว (LP สำหรับระยะสั้น) และแบบแบนด์พาส (BP สำหรับแบบสั้น) ซึ่งจำเป็นต้องเลือกตามความต้องการเช่นกัน
ทางเลือกของแหล่งกำเนิดแสงฟลูออเรสเซนต์
แหล่งกำเนิดแสงฟลูออเรสเซนต์ที่ใช้กันทั่วไปในปัจจุบัน ได้แก่ หลอดปรอท หลอดเมทัลฮาไลด์ และแหล่งกำเนิดแสง LED ซึ่งมีการพัฒนาอย่างรวดเร็วในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา สเปกตรัมของแหล่งกำเนิดแสงฟลูออเรสเซนต์เป็นแบบต่อเนื่องและไม่ต่อเนื่อง และพลังงานจะแตกต่างกันในแถบต่างๆ เนื่องจากแถบสเปกตรัมที่ค่อนข้างแคบ เอาต์พุตพลังงานที่เสถียรกว่า อายุการใช้งานที่ยาวนาน ความปลอดภัยและการปกป้องสิ่งแวดล้อม และข้อดีอื่นๆ อีกมากมาย แหล่งกำเนิดแสง LED จึงค่อยๆ กลายเป็นแหล่งกำเนิดแสงหลักของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์
กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล
ในการสังเกตการณ์ด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงแบบดั้งเดิม เนื่องจากการซ้อนทับกันของสารเครื่องหมายเรืองแสงและโครงสร้างของสารเรืองแสงอัตโนมัติ พวกมันจะถูกรวมเข้าด้วยกันอย่างใกล้ชิด ในขณะที่เลนส์ใกล้วัตถุของกล้องจุลทรรศน์ epi-fluorescence แบบดั้งเดิมไม่เพียงแต่รวบรวมแสงจากระนาบโฟกัสเท่านั้น แต่ยังรวบรวมแสงที่กระจัดกระจายด้านบนและด้านล่างของ ระนาบโฟกัส ทำให้ความละเอียดและคอนทราสต์ของภาพลดลงอย่างมาก
การถ่ายภาพแบบคอนโฟคอลแก้ปัญหานี้ด้วยการตรวจจับเฉพาะส่วนของแสงที่สะท้อนจากระนาบโฟกัส แหล่งกำเนิดแสงผ่านรูเข็มเพื่อสร้างจุดแสงขนาดเล็กและละเอียดบนระนาบโฟกัส แสงที่ปล่อยออกมาจากระนาบโฟกัสจะถูกรวบรวมโดยเลนส์ใกล้วัตถุ แสงฟลูออเรสเซนต์ส่วนใหญ่ที่ปล่อยออกมาจากจุดด้านบนหรือด้านล่างของระนาบโฟกัสของเลนส์ใกล้วัตถุไม่สามารถบรรจบกับรูเล็กๆ มีเพียงแสงฟลูออเรสเซนต์ที่อยู่ในระนาบโฟกัสและส่วนเล็กๆ ของฟลูออเรสเซนต์นอกโฟกัสเท่านั้นที่สามารถผ่านรูเข็มได้ ในขณะที่ลำแสงที่อยู่นอกระนาบโฟกัสจะมาบรรจบกันที่ด้านหน้าหรือด้านหลังของแผ่นรูเข็ม และถูกปิดกั้นไม่ให้เข้าสู่เครื่องตรวจจับผ่าน รูเข็ม ภาพที่ตรวจพบคือภาพจากระนาบโฟกัส ดังนั้นคุณภาพของภาพสุดท้ายจึงดีขึ้นอย่างมาก
เนื่องจากข้อได้เปรียบและการใช้งานได้จริงของฟังก์ชั่นของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลสแกนด้วยเลเซอร์ กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลจึงเป็นผู้ช่วยทดลองที่ขาดไม่ได้ในด้านชีววิทยาเซลล์ พฤกษศาสตร์ และการวิจัยเซลล์ที่มีความแม่นยำสูง ในเวลาเดียวกัน ศูนย์วิจัยทางวิทยาศาสตร์ในอนาคตจะเป็นเครื่องมือวิจัยทางวิทยาศาสตร์ที่เป็นพื้นฐานและเป็นแกนหลักที่สุด
