การจำแนกและหลักการทำงานของกล้องจุลทรรศน์สำหรับการวิจัยเซลล์

การจำแนกและหลักการทำงานของกล้องจุลทรรศน์สำหรับการวิจัยเซลล์

กล้องจุลทรรศน์เป็นเครื่องมือหลักในการสังเกตเซลล์ ตามแหล่งกำเนิดแสงที่แตกต่างกัน มันสามารถแบ่งออกเป็นสองประเภท: กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงและกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน แบบแรกใช้แสงที่มองเห็นได้ (กล้องจุลทรรศน์ UV ใช้แสงอัลตราไวโอเลต) เป็นแหล่งกำเนิดแสง ในขณะที่แบบหลังใช้ลำแสงอิเล็กตรอนเป็นแหล่งกำเนิดแสง

-,กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง

(1) กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงธรรมดา

กล้องจุลทรรศน์ชีวภาพทั่วไปประกอบด้วยสามส่วน ได้แก่ ① ระบบส่องสว่าง รวมทั้งแหล่งกำเนิดแสงและคอนเดนเซอร์ ② ระบบขยายแสง ประกอบด้วยเลนส์ใกล้วัตถุและเลนส์ใกล้ตา ซึ่งเป็นส่วนประกอบหลักของกล้องจุลทรรศน์ เพื่อขจัดความคลาดเคลื่อนทรงกลมและความคลาดเคลื่อนของสี ทั้งเลนส์ตาและวัตถุ ③อุปกรณ์เชิงกล ใช้เพื่อยึดวัสดุและอำนวยความสะดวกในการสังเกต (รูป 2-1)

ภาพของกล้องจุลทรรศน์มีความชัดเจนหรือไม่นั้นไม่ได้พิจารณาจากการขยายเท่านั้น แต่ยังเกี่ยวข้องกับความละเอียดของกล้องจุลทรรศน์ด้วย ความละเอียดหมายถึงความสามารถของกล้องจุลทรรศน์ (หรือสายตามนุษย์ที่อยู่ห่างจากเป้าหมาย 25 ซม.) เพื่อแยกแยะระยะห่างที่เล็กที่สุดระหว่างวัตถุ ขนาดของความละเอียดถูกกำหนดโดย อัตราส่วนความยาวคลื่นและรูรับแสงของแสงและดัชนีการหักเหของแสงของตัวกลางแสดงโดยสูตร:

ในสูตร: n=ดัชนีหักเหของตัวกลาง;=มุมรูรับแสง (มุมเปิดของชิ้นงานทดสอบไปยังรูรับแสงของเลนส์ใกล้วัตถุ), รูรับแสงของเลนส์ NA=(รูรับแสงแบบตัวเลข) มุมเลนส์จะน้อยกว่า 180 องศาเสมอ ดังนั้นค่าสูงสุดของ sina/2 จะต้องน้อยกว่า 1

ดัชนีการหักเหของแสงของแก้วที่ใช้ทำเลนส์สายตาคือ 1.65 ถึง 1.78 และดัชนีการหักเหของแสงของตัวกลางที่ใช้ใกล้กับกระจกมากเท่าไหร่ก็ยิ่งดีเท่านั้น สำหรับเลนส์ใกล้วัตถุแบบแห้ง สื่อกลางคืออากาศ และอัตราส่วนรูรับแสงของเลนส์โดยทั่วไปคือ 0.05 ถึง 0.95; สำหรับเลนส์น้ำมัน ใช้น้ำมันซีดาร์เป็นสื่อกลาง และอัตราส่วนรูรับแสงของเลนส์สามารถใกล้เคียงกับ 1.5

ความยาวคลื่นของแสงธรรมดาคือ {{0}}nm ดังนั้นค่าความละเอียดของกล้องจุลทรรศน์จะไม่ต่ำกว่า 0.2μm และความละเอียดของสายตามนุษย์คือ 0.2 มม. ดังนั้น กำลังขยายสูงสุดของการออกแบบกล้องจุลทรรศน์โดยทั่วไปคือ 1,000X

(2) กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง

สารบางชนิดในเซลล์ เช่น คลอโรฟิลล์ สามารถเรืองแสงได้หลังจากถูกฉายรังสีอัลตราไวโอเลต สารบางชนิดไม่สามารถเรืองแสงได้ แต่ถ้าถูกย้อมด้วยสีย้อมเรืองแสงหรือแอนติบอดีเรืองแสง สารเหล่านี้ก็สามารถเรืองแสงได้เช่นกันเมื่อฉายรังสีด้วยรังสีอัลตราไวโอเลต และกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (รูปที่ 2-2, 3, 4) เป็นเครื่องมืออย่างหนึ่ง เพื่อการวิจัยเชิงคุณภาพและเชิงปริมาณเกี่ยวกับสารดังกล่าว

กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงและกล้องจุลทรรศน์ธรรมดามีข้อแตกต่างดังนี้

1. วิธีการฉายแสงโดยทั่วไปคือการฉายแสงแบบอีพิ-ไลลูมิเนชั่น กล่าวคือ ฉายแหล่งกำเนิดแสงบนตัวอย่างผ่านเลนส์ใกล้วัตถุ (ภาพ 2-3)

2. แหล่งกำเนิดแสงคือแสงอัลตราไวโอเลต ความยาวคลื่นสั้นกว่า และความละเอียดสูงกว่ากล้องจุลทรรศน์ธรรมดา

3. มีฟิลเตอร์พิเศษสองอัน อันหนึ่งอยู่ด้านหน้าแหล่งกำเนิดแสงใช้เพื่อกรองแสงที่มองเห็น และอีกอันระหว่างเลนส์ใกล้ตากับเลนส์ใกล้วัตถุใช้เพื่อกรองแสงอัลตราไวโอเลตเพื่อปกป้องดวงตา

(3) กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลสแกนด้วยเลเซอร์

กล้องจุลทรรศน์สแกนคอนโฟคอลเลเซอร์ (กล้องจุลทรรศน์สแกนคอนโฟคอลเลเซอร์ รูปที่ 2-5, 6) ใช้เลเซอร์เป็นแหล่งกำเนิดแสงในการสแกน และสแกนภาพแบบจุดต่อจุด บรรทัดต่อบรรทัด พื้นผิวต่อพื้นผิว และเลเซอร์สแกนและคอลเลกชันเรืองแสงใช้ร่วมกัน เลนส์ใกล้วัตถุ และโฟกัสของเลนส์ใกล้วัตถุคือ จุดโฟกัสของเลเซอร์สแกนยังเป็นจุดวัตถุของการถ่ายภาพทันที เนื่องจากความยาวคลื่นของลำแสงเลเซอร์สั้นและลำแสงบางมาก กล้องจุลทรรศน์แบบสแกนด้วยเลเซอร์คอนโฟคอลจึงมีความละเอียดสูงกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงทั่วไปประมาณ 3 เท่า ระบบจะโฟกัสเพียงครั้งเดียวและการสแกนจะจำกัดไว้ที่ระนาบเดียวของตัวอย่าง เมื่อความลึกของการโฟกัสแตกต่างกัน จะสามารถรับภาพที่มีระดับความลึกที่แตกต่างกันของตัวอย่างได้ ข้อมูลรูปภาพเหล่านี้จะถูกเก็บไว้ในคอมพิวเตอร์ ด้วยการวิเคราะห์และการจำลองด้วยคอมพิวเตอร์ ทำให้สามารถแสดงโครงสร้างสามมิติของตัวอย่างเซลล์ได้

กล้องจุลทรรศน์แบบส่องกราดด้วยเลเซอร์คอนโฟคอลไม่เพียงแต่ใช้สังเกตสัณฐานวิทยาของเซลล์เท่านั้น แต่ยังใช้สำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณของส่วนประกอบทางชีวเคมีภายในเซลล์ สถิติความหนาแน่นของแสง และการวัดสัณฐานวิทยาของเซลล์ด้วย

(4) กล้องจุลทรรศน์สนามมืด

กล้องจุลทรรศน์สนามมืด (dark field microscope, รูปที่ 2-7) มีแผ่นแสงอยู่ตรงกลางของคอนเดนเซอร์ เพื่อไม่ให้แสงส่องสว่างเข้าสู่เลนส์ของมนุษย์โดยตรง และจะมีเฉพาะแสงที่สะท้อนและหักเหจากชิ้นงาน ได้รับอนุญาตให้เข้าสู่เลนส์ใกล้วัตถุ ดังนั้นพื้นหลังของขอบเขตการมองเห็นจึงเป็นสีดำ ขอบของวัตถุจะสว่าง เมื่อใช้กล้องจุลทรรศน์นี้ จะเห็นอนุภาคขนาดเล็กถึง 4-200นาโนเมตร และมีความละเอียดสูงกว่ากล้องจุลทรรศน์ธรรมดาถึง 50 เท่า

(5) กล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์เฟส

Phasecontrast microscope (phasecontrast microscope, รูปที่ 2-8, 9) โดย P. Zernike ถูกประดิษฐ์ขึ้นในปี 1932 และได้รับรางวัลโนเบลสาขาฟิสิกส์ในปี 1953 สำหรับมัน คุณสมบัติที่ใหญ่ที่สุดของกล้องจุลทรรศน์นี้คือสามารถสังเกตตัวอย่างและเซลล์ที่มีชีวิตที่ไม่มีสี

หลักการพื้นฐานของกล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์เฟสคือการเปลี่ยนความแตกต่างของเส้นทางแสงของแสงที่มองเห็นผ่านชิ้นงานให้เป็นความแตกต่างของแอมพลิจูด ซึ่งจะเป็นการปรับปรุงคอนทราสต์ระหว่างโครงสร้างต่างๆ และทำให้โครงสร้างต่างๆ มองเห็นได้ชัดเจน หลังจากผ่านชิ้นงานแล้ว แสงจะหักเห เบี่ยงเบนไปจากเส้นทางแสงเดิม และล่าช้าไป 1/4λ (ความยาวคลื่น) เพิ่มหรือลดแอมพลิจูด เพิ่มคอนทราสต์ ในแง่ของโครงสร้าง กล้องจุลทรรศน์แบบคอนทราสต์เฟสมีคุณสมบัติพิเศษ 2 ประการที่แตกต่างจากกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงทั่วไป ได้แก่

1. ไดอะแฟรมรูปวงแหวนตั้งอยู่ระหว่างแหล่งกำเนิดแสงและคอนเดนเซอร์ และหน้าที่ของมันคือการทำให้แสงที่ผ่านคอนเดนเซอร์กลายเป็นกรวยแสงกลวงและโฟกัสไปที่ชิ้นงาน

2. แผ่นเฟส (แผ่นเฟสรูปวงแหวน) เพิ่มแผ่นเฟสที่เคลือบด้วยแมกนีเซียมฟลูออไรด์ในเลนส์ใกล้วัตถุ ซึ่งสามารถหน่วงเฟสของแสงตรงหรือแสงที่เลี้ยวเบนได้ 1/4λ มีสองประเภท:

①A plus phase plate: แสงตรงถูกหน่วงเวลา 1/4λ หลังจากรวมคลื่นแสงทั้งสองกลุ่มแล้ว คลื่นแสงจะถูกรวมเข้าด้วยกันและแอมพลิจูดจะเพิ่มขึ้น โครงสร้างของชิ้นงานสว่างกว่าตัวกลางที่อยู่รอบๆ ทำให้เกิดคอนทราสต์สว่าง (หรือคอนทราสต์เชิงลบ)

② B plus phase plate: แสงที่เลี้ยวเบนล่าช้า 1/4λ หลังจากที่รังสีทั้งสองชุดรวมกัน คลื่นแสงจะถูกหักออก และแอมพลิจูดจะเล็กลง เกิดเป็นคอนทราสต์ที่มืด (หรือคอนทราสต์ในเชิงบวก) และโครงสร้างจะมืดกว่าตัวกลางที่อยู่รอบๆ

(6) กล้องจุลทรรศน์โพลาไรซ์

กล้องจุลทรรศน์แบบโพลาไรซ์ใช้ในการตรวจจับสารที่มีไบรีฟริงเจนซ์ เช่น เส้นใย สปินเดิล คอลลาเจน โครโมโซม และอื่นๆ ความแตกต่างจากกล้องจุลทรรศน์ธรรมดาคือมีโพลาไรเซอร์ (โพลาไรเซอร์) อยู่ด้านหน้าแหล่งกำเนิดแสง ดังนั้นแสงที่เข้าสู่กล้องจุลทรรศน์จึงเป็นแสงโพลาไรซ์ และมีตัววิเคราะห์ (โพลาไรเซอร์ที่มีทิศทางของโพลาไรซ์ตั้งฉากกับโพลาไรเซอร์) กระบอกเลนส์ ระยะของกล้องจุลทรรศน์นี้สามารถหมุนได้ เมื่อวางสารหักเหเดี่ยวไว้บนเวที ไม่ว่าเวทีจะหมุนอย่างไร เนื่องจากโพลาไรเซอร์ทั้งสองอยู่ในแนวตั้ง จึงมองไม่เห็นแสงในกล้องจุลทรรศน์ และมองไม่เห็นแสงในกล้องจุลทรรศน์ เมื่อป้อนวัสดุไบรีฟริงเจนต์ แท่นหมุนสามารถตรวจจับวัตถุดังกล่าวได้เนื่องจากแสงจะเบี่ยงเบนเมื่อผ่านวัสดุดังกล่าว