หลักการของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล
กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเป็นเครื่องมือสร้างภาพที่มีความแม่นยำสูงซึ่งถือกำเนิดขึ้นและพัฒนาขึ้นในทศวรรษที่ 1980 และเป็นเครื่องมือวิจัยทางวิทยาศาสตร์ที่จำเป็นสำหรับการศึกษาโครงสร้างซับไมครอน ด้วยการพัฒนาคอมพิวเตอร์ ซอฟต์แวร์ประมวลผลภาพ และเลเซอร์ กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลก็ได้รับการพัฒนาอย่างมากเช่นกัน และปัจจุบันมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในด้านชีววิทยา ระบบไมโคร และการวัดวัสดุ กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเป็นกล้องจุลทรรศน์ชนิดใหม่ที่รวมหลักการคอนโฟคอล เทคโนโลยีการสแกน และเทคโนโลยีการประมวลผลด้วยคอมพิวเตอร์กราฟิก ข้อได้เปรียบหลักคือ: ความละเอียดด้านข้างสูงและความละเอียดตามแนวแกนสูง และการยับยั้งแสงรบกวนอย่างมีประสิทธิภาพ พร้อมความเปรียบต่างสูง
การติดตั้งกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลโดยทั่วไปคือการวางรูเล็กๆ สองรูบนระนาบคอนจูเกตของระนาบโฟกัสของวัตถุที่วัดได้ โดยรูหนึ่งจะวางไว้ด้านหน้าแหล่งกำเนิดแสง และอีกรูหนึ่งจะวางไว้ด้านหน้าเครื่องตรวจจับ ดังแสดงในภาพ 1. จะเห็นได้จากรูปว่าเมื่อตัวอย่างที่วัดได้อยู่ในระนาบกึ่งโฟกัส ความเข้มของแสงที่ปลายตรวจจับจะเก็บได้มากที่สุด เมื่อตัวอย่างที่วัดได้อยู่ในตำแหน่งนอกโฟกัส จุดแสงที่ปลายการตรวจจับจะกระจายและความเข้มของแสงจะลดลงอย่างรวดเร็ว ดังนั้น เฉพาะแสงที่ปล่อยออกมาจากจุดบนระนาบโฟกัสเท่านั้นที่สามารถผ่านรูเข็มทางออกได้ ในขณะที่แสงที่ปล่อยออกมาจากจุดนอกระนาบโฟกัสจะไม่โฟกัสบนระนาบรูเข็มทางออก และแสงส่วนใหญ่ไม่สามารถผ่านรูเข็มกลางได้ ดังนั้น จุดสังเกตบนระนาบโฟกัสจึงดูสว่าง และจุดที่ไม่ใช่จุดสังเกตจะปรากฏเป็นพื้นหลังเป็นสีดำ เพิ่มความเปรียบต่างและทำให้ภาพชัดเจนขึ้น ในระหว่างขั้นตอนการถ่ายภาพ รูเข็มทั้งสองคือคอนโฟคอล จุดคอนโฟคอลคือจุดที่ตรวจพบ และระนาบที่ตำแหน่งของจุดที่ตรวจพบคือระนาบคอนโฟคอล
ขนาดของรูเข็มที่เครื่องตรวจจับในกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลมีบทบาทสำคัญ ส่งผลโดยตรงต่อความละเอียดและอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนของระบบ หากรูเข็มใหญ่เกินไป เอฟเฟ็กต์การตรวจจับคอนโฟคอลจะไม่บรรลุผล ซึ่งไม่เพียงแต่ลดความละเอียดของระบบ แต่ยังทำให้มีแสงเล็ดลอดเข้ามามากขึ้น หากรูเข็มเล็กเกินไปจะทำให้ประสิทธิภาพการตรวจจับลดลงและลดภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์ ความสว่าง การศึกษาพบว่าเมื่อเส้นผ่านศูนย์กลางของรูเข็มเท่ากับเส้นผ่านศูนย์กลางของดิสก์ Airy จะเป็นไปตามข้อกำหนดคอนโฟคอล และประสิทธิภาพการตรวจจับจะไม่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ เนื่องจากโดยทั่วไปเส้นผ่านศูนย์กลางของรูเข็มจะเรียงตามลำดับไมครอน หากมีความเบี่ยงเบนระหว่างจุดโฟกัสของลำแสงเลเซอร์และตำแหน่งของรูเข็ม สัญญาณจะผิดเพี้ยน ดังนั้น โดยทั่วไปแล้ว กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลจะใช้ระบบโฟกัสอัตโนมัติ ซึ่งจะเพิ่มเวลาในการตรวจวัด
เนื่องจากกล้องจุลทรรศน์สแกนคอนโฟคอลแบบเลเซอร์เป็นการถ่ายภาพแบบจุด เพื่อให้ได้ภาพสองมิติของวัตถุ จึงจำเป็นต้องใช้การสแกนแบบสองมิติในทิศทาง x และ y กล้องจุลทรรศน์ที่แตกต่างกันใช้วิธีการสแกนที่แตกต่างกัน:
(1) การสแกนวัตถุ นั่นคือวัตถุเคลื่อนที่ตามกฎบางอย่างในขณะที่ลำแสงยังคงไม่เปลี่ยนแปลง ข้อดี: เส้นทางแสงที่เสถียร ข้อเสีย: ต้องใช้ตารางการสแกนขนาดใหญ่ ดังนั้นความเร็วในการสแกนจึงถูกจำกัดอย่างมาก
(2) ระบบสแกนลำแสงถูกสร้างขึ้นโดยใช้กัลวาโนมิเตอร์แบบสะท้อนแสง นั่นคือ โดยการควบคุมกัลวาโนมิเตอร์การสแกน จุดแสงที่โฟกัสจะสะท้อนไปยังชั้นหนึ่งของวัตถุเป็นประจำเพื่อทำการสแกนสองมิติให้เสร็จสมบูรณ์ ข้อดีของมันคือมีความแม่นยำสูงและมักใช้สำหรับการวัดที่มีความแม่นยำสูง ความเร็วในการสแกนดีขึ้นกว่าการสแกนวัตถุ แต่ก็ยังไม่เร็วนัก
(3) ใช้องค์ประกอบการเบี่ยงเบนของอะคูสติกออปติกในการสแกน และการสแกนจะเกิดขึ้นโดยการเปลี่ยนความถี่เอาต์พุตของคลื่นเสียง จากนั้นจึงเปลี่ยนทิศทางการส่งของคลื่นแสง ข้อได้เปรียบที่โดดเด่นคือความเร็วในการสแกนที่รวดเร็วมาก ระบบการสแกนที่พัฒนาโดยสหรัฐอเมริกาใช้ตัวเบี่ยงสัญญาณเสียงเพื่อสร้างภาพวิดีโอแบบเรียลไทม์ ใช้เวลาเพียง 1/30 วินาทีในการสแกนภาพสองมิติ และเกือบจะได้ผลลัพธ์แบบเรียลไทม์
(4) การสแกนดิสก์ของ Nipkow กระบวนการสแกนเสร็จสิ้นโดยการหมุนดิสก์ Nipkow ขณะที่ส่วนประกอบอื่นๆ ยังคงอยู่ สามารถถ่ายภาพได้ในครั้งเดียวและความเร็วนั้นเร็วมาก อย่างไรก็ตาม เนื่องจากลำแสงสร้างภาพเป็นแสงนอกแกน จึงต้องแก้ไขความคลาดเคลื่อนนอกแกนของเลนส์ และอัตราการใช้พลังงานแสงต่ำมาก
