หลักการของกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แตกต่างจากกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงทั่วไป แทนที่จะสังเกตชิ้นงานภายใต้การส่องสว่างของแหล่งกำเนิดแสงทั่วไป พวกเขาใช้แสงที่มีความยาวคลื่นหนึ่งๆ (โดยปกติคือแสงอัลตราไวโอเลต แสงสีน้ำเงิน-ม่วง) เพื่อกระตุ้นสารเรืองแสงในตัวอย่างภายใต้กล้องจุลทรรศน์เพื่อให้เปล่งแสงเรืองแสงออกมา ดังนั้น แหล่งกำเนิดแสงของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์จึงไม่ทำหน้าที่เป็นการส่องสว่างโดยตรง แต่เป็นแหล่งพลังงานที่กระตุ้นสารเรืองแสงภายในชิ้นงาน เหตุผลที่เราสามารถสังเกตชิ้นงานได้เนื่องจากการส่องสว่างของแหล่งกำเนิดแสง แต่ปรากฏการณ์เรืองแสงที่นำเสนอหลังจากสารเรืองแสงในชิ้นงานดูดซับพลังงานแสงที่กระตุ้น
จะเห็นได้ว่าลักษณะเฉพาะของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์คือแหล่งกำเนิดแสงสามารถให้แสงกระตุ้นในปริมาณมากในช่วงความยาวคลื่นเฉพาะ เพื่อให้สารเรืองแสงในชิ้นงานทดสอบได้รับแสงกระตุ้นที่มีความเข้มที่จำเป็น ในเวลาเดียวกัน กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ต้องมีระบบกรองที่สอดคล้องกัน
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์เป็นเครื่องมือสำคัญในฮิสโตเคมีของอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ ประกอบด้วยแหล่งกำเนิดแสงแรงดันสูงพิเศษ ระบบกรอง (รวมถึงแผ่นกรองกระตุ้นและปราบปราม) ระบบออพติคอล และระบบถ่ายภาพ และส่วนประกอบหลักอื่นๆ ใช้แสงที่มีความยาวคลื่นหนึ่งเพื่อกระตุ้นชิ้นงานให้เปล่งแสงฟลูออเรสเซนซ์
วิธีกระตุ้นการเรืองแสง: ตามช่วงความยาวคลื่นของแสง สามารถแบ่งออกได้เป็น 2 ประเภท ได้แก่ วิธีกระตุ้นด้วยแสง UV (โดยใช้แสงอัลตราไวโอเลต) และวิธีการกระตุ้น BV (ใช้แสงสีน้ำเงิน-ม่วง) วิธีการกระตุ้นด้วยรังสียูวีใช้แสงใกล้รังสีอัลตราไวโอเลตที่สั้นกว่า 400 นาโนเมตรในการกระตุ้น ไม่มีแสงกระตุ้นที่มองเห็นได้ในวิธีนี้ ดังนั้นการเรืองแสงที่สังเกตได้จึงแสดงการเรืองแสงตามธรรมชาติของสีย้อม และเป็นการง่ายที่จะแยกแยะการเรืองแสงเฉพาะบนชิ้นงานจากการเรืองแสงอัตโนมัติของเนื้อเยื่อพื้นหลัง
วิธีการกระตุ้น BV ใช้ 404nm และ 434nm สำหรับการกระตุ้นจากแสงอัลตราไวโอเลตถึงแสงสีน้ำเงิน วิธีการนี้ใช้แสงสีน้ำเงินฉายรังสีไปยังชิ้นงาน ดังนั้นตัวกรองแบบตัดของระบบการสังเกตการเรืองแสงจึงต้องใช้ตัวกรองที่สามารถปิดกั้นแสงสีน้ำเงินได้อย่างสมบูรณ์และส่งผ่านสารเรืองแสงสีเขียวและสีเหลืองที่ต้องการได้อย่างเต็มที่ สีย้อมเรืองแสงสำหรับการตรวจหาแอนติบอดีเรืองแสง ความยาวคลื่นการดูดซับสูงสุดของแสงกระตุ้นค่อนข้างใกล้เคียงกับความยาวคลื่นการแผ่รังสีสูงสุดของฟลูออเรสเซนซ์ ดังนั้นตัวกรองที่ใช้ในวิธีการกระตุ้น BV จึงต้องใช้ตัวกรองแบบคมตัด วิธีนี้สามารถใช้แสงสีน้ำเงินเป็นแสงกระตุ้น ดังนั้นประสิทธิภาพการดูดซับของเม็ดสีเรืองแสงจึงสูงขึ้น และทำให้ได้ภาพที่สว่างขึ้น ข้อเสียของมันคือไม่สามารถมองเห็นการเรืองแสงที่ต่ำกว่า 500 นาโนเมตร และการเรืองแสงที่สูงกว่า 500 นาโนเมตรจะทำให้ภาพทั้งหมดปรากฏเป็นสีเหลือง ในวิธีแอนติบอดีเรืองแสง ความจำเพาะของฟลูออโรโครมมักตัดสินจากสีเฉพาะของฟลูออโรโครม ดังนั้น เมื่อพูดถึงความเฉพาะเจาะจงที่ลึกซึ้ง ข้อบกพร่องดังกล่าวข้างต้นของวิธีการกระตุ้น BV มักจะมีอิทธิพลอย่างมาก
โดยสรุปแล้ว การส่องสว่างของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์สามารถพิจารณาตามจุดสามจุดต่อไปนี้ตามโครงสร้างของคอนเดนเซอร์และความยาวคลื่นของแสงกระตุ้น
① จากมุมมองของข้อกำหนดคอนทราสต์ของภาพเรืองแสง จะใช้หัวกระตุ้นสนามมืดแบบกระตุ้นรังสี UV สำหรับการส่องสว่าง
② เมื่อพิจารณาถึงความสว่างของภาพ ฟิลเตอร์กระตุ้น BV มีประสิทธิภาพการสังเกตฟิลด์มืดสูงสุด
③ลักษณะของการสังเกตการณ์สนามมืดด้วยตัวกรองการกระตุ้นด้วยรังสี UV และการส่องสว่างด้วยความเข้มข้นของสนามมืดแบบกระตุ้น BV สามารถพิจารณาได้ว่าอยู่ระหว่างสองวิธีการส่องสว่าง แต่วิธีแรกมีคุณสมบัติของสนามมืดที่แข็งแกร่งกว่าและแสดงภาพที่สว่างกว่า ความคมชัดมีขนาดเล็ก ส่วนหลังยังคงคุณสมบัติของเส้นทางแสงของสนามมืด ดังนั้นภาพที่แสดงจึงมืดลงและคอนทราสต์ดีขึ้น เมื่อใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์จริง ๆ ควรใช้วิธีการส่องสว่างที่เหมาะสมกับความต้องการของชิ้นงานมากที่สุดสำหรับการสังเกต
ต้องชี้ให้เห็นว่าแม้ว่าคอนเดนเซอร์สนามมืดที่กระตุ้นด้วยรังสียูวีซึ่งมีคอนทราสต์ดีที่สุดจะสว่างขึ้น แต่แสงกระตุ้นอัลตราไวโอเลตส่วนหนึ่งที่หักเหหรือกระจัดกระจายโดยชิ้นงานจะเข้าสู่เลนส์ใกล้วัตถุ การเรืองแสงอัตโนมัติอาจทำให้การตอบสนองของภาพแย่ลง ดังนั้นจึงต้องใช้ฟิลเตอร์ดูดซับรังสียูวีที่ด้านหน้าของช่องมองภาพเป็นฟิลเตอร์ตัดแสง
