เทคนิคการย้อมสีและการสังเกตจุลชีพด้วยกล้องจุลทรรศน์

เทคนิคการย้อมสีและการสังเกตจุลชีพด้วยกล้องจุลทรรศน์

การย้อมสีแบคทีเรียอย่างง่าย
1 วัตถุประสงค์

1.1 เพื่อเรียนรู้เทคนิคเบื้องต้นในการสเมียร์และการย้อมสีจุลินทรีย์

1.2 เพื่อเชี่ยวชาญวิธีการย้อมสีแบคทีเรียอย่างง่าย

1.3 เพื่อทราบลักษณะทางสัณฐานวิทยาของแบคทีเรีย และรวบรวมการเรียนรู้การใช้กระจกเงาน้ำมันและเทคนิคการทำงานปลอดเชื้อ

หลักการที่ 2 การละเลงและการย้อมสีแบคทีเรียเป็นเทคนิคพื้นฐานในการทดลองทางจุลชีววิทยา เซลล์ของแบคทีเรียมีขนาดเล็กและโปร่งใส ไม่สามารถจดจำได้ง่ายด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงธรรมดา และจะต้องเปื้อนด้วย การใช้สีย้อมเดี่ยวเพื่อย้อมแบคทีเรีย เพื่อให้สิ่งมีชีวิตที่เปื้อนสีและพื้นหลังสร้างความแตกต่างของสีที่ชัดเจน เพื่อให้สามารถสังเกตสัณฐานวิทยาและโครงสร้างของพวกมันได้ชัดเจนยิ่งขึ้น วิธีนี้ทำได้ง่ายและเหมาะกับการสังเกตรูปร่างทั่วไปของสิ่งมีชีวิตและการจัดเรียงตัวของแบคทีเรีย สีย้อมอัลคาไลน์มักใช้สำหรับการย้อมสีธรรมดา เนื่องจากในสารละลายที่เป็นกลาง เป็นด่าง หรือเป็นกรดอ่อน เซลล์แบคทีเรียมักจะมีประจุลบ และเมื่อสีย้อมอัลคาไลน์ถูกไอออนไนซ์ ส่วนที่เป็นคราบของโมเลกุลจะมีประจุบวก ดังนั้นส่วนที่ย้อมสีของสีย้อมอัลคาไลน์ สามารถจับกับแบคทีเรียได้ง่ายเพื่อทำให้แบคทีเรียมีสี เซลล์แบคทีเรียที่เปื้อนสีตัดกันอย่างชัดเจนกับพื้นหลัง และง่ายต่อการจดจำภายใต้กล้องจุลทรรศน์ สีย้อมที่ใช้กันทั่วไปสำหรับการย้อมแบบธรรมดา ได้แก่ สีฟ้าเมอโรไซยานีน สีม่วงคริสตัล และสีแดงผสมพื้นฐาน เมื่อแบคทีเรียสลายน้ำตาลให้ผลิตกรดจนค่า pH ของตัวกลางลดลง ประจุบวกของแบคทีเรียจะเพิ่มขึ้น จากนั้นจึงสามารถนำมาใช้ในการย้อมสีแดง สีแดงที่เป็นกรด หรือสีแดงคองโก และสีย้อมที่เป็นกรดอื่นๆ ต้องแก้ไขแบคทีเรียก่อนการย้อมสี จุดประสงค์คือสองประการ: หนึ่งคือเพื่อฆ่าเชื้อแบคทีเรียและทำให้แบคทีเรียเกาะติดกับสไลด์; ประการที่สองคือการเพิ่มความสัมพันธ์กับสีย้อม โดยทั่วไปจะใช้สองวิธี: การทำความร้อนและการตรึงสารเคมี พยายามรักษาสัณฐานวิทยาดั้งเดิมของเซลล์เมื่อทำการซ่อม

3 วัสดุ
3.1 สายพันธุ์ Bacillus subtilis 12-18h การเพาะเลี้ยงวุ้นด้วยสารอาหาร, Staphylococcus aureus ประมาณ 24 ชม. การเพาะเลี้ยงวุ้นด้วยสารอาหาร, Escherichia coli 24 ชม. การเพาะเลี้ยงวุ้นด้วยสารอาหาร, การเพาะเลี้ยงวุ้นด้วยสารอาหารของยีสต์ขนมปัง

3.2 คราบอัลคาไลน์เมทิลีนบลูสเตน (หรือคราบสีม่วงคริสตัลแอมโมเนียมออกซาเลต) คราบแดงผสมกรดคาร์โบลิก

3.3 เครื่องมือหรืออุปกรณ์อื่นๆ กล้องจุลทรรศน์ ตะเกียงแอลกอฮอล์ สไลด์ วงแหวนฉีดวัคซีน ที่วางสไลด์ ขวด 2 ชั้น (เติมน้ำมันซีดาร์และไซลีน) กระดาษกล้องจุลทรรศน์ น้ำเกลือทางสรีรวิทยาหรือน้ำกลั่น เป็นต้น

4 ขั้นตอน ทา→ การทำให้แห้ง → การตรึง → การย้อมสี → การซัก → การทำให้แห้ง → การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์

5 ขั้นตอน
5.1 สเมียร์ นำสไลด์ที่สะอาดและปราศจากน้ำมันสองแผ่น โดยแต่ละสไลด์จะมีหยดน้ำเกลือ (หรือน้ำกลั่น) หยดเล็กๆ อยู่ตรงกลางสไลด์ภายใต้สภาวะปลอดเชื้อ โดยมีวงแหวนสำหรับฉีดเชื้อเพื่อการทำงานปลอดเชื้อ ตามลำดับ จาก Bacillus subtilis, Garcinia micrococcus และ Escherichia coli เอียงหยิบตะไคร่น้ำเล็กน้อยในหยดน้ำ ผสมและเคลือบด้วยฟิล์ม หากสารแขวนลอยของแบคทีเรีย (หรือการเพาะเลี้ยงของเหลว) เปื้อน สามารถใช้ฉีดวัคซีนวงแหวนได้ ให้เลือกวงแหวน 2 ถึง 3 วงโดยตรงบนสไลด์ โปรดทราบว่าน้ำเกลือ (น้ำกลั่น) และพาแบคทีเรียไม่ควรมากเกินไปและกระจายอย่างสม่ำเสมอไม่หนาเกินไป

5.2 การอบแห้ง ตากให้แห้งตามธรรมชาติที่อุณหภูมิห้อง นอกจากนี้ยังสามารถทำให้แห้งได้โดยให้ความร้อนเหนือตะเกียงแอลกอฮอล์เล็กน้อยโดยหงายด้านที่เคลือบไว้ แต่อย่าเข้าใกล้เปลวไฟมากเกินไปเพราะว่าอุณหภูมิสูงเกินไปจะทำลายรูปร่างของแบคทีเรียได้

5.3 การตรึง หากใช้การอบแห้งด้วยความร้อน การตรึงและการอบแห้งจะรวมกันเป็นขั้นตอนเดียวในลักษณะเดียวกับการอบแห้ง รอยเปื้อน แห้ง และแก้ไขด้วยความร้อน

5.4 การย้อมสี วางสไลด์ให้ราบบนชั้นวางสไลด์ เติมน้ำยาย้อมสี 1 ถึง 2 หยดลงบนสเมียร์ (น้ำยาย้อมสีเพียงคลุมฟิล์มสเมียร์เท่านั้นก็เหมาะสม) เปื้อนสเมียร์ด้วย Lü's Basic Mellanox Blue เป็นเวลา 1~2 นาที และด้วยสีแดงคาร์บอเนต (หรือแอมโมเนียมออกซาเลตคริสตัลไวโอเล็ต) เป็นเวลาประมาณ 1 นาที

5.5 การล้าง เทสารละลายคราบออกแล้วค่อย ๆ ล้างด้วยน้ำประปาจากปลายด้านหนึ่งของสไลด์จนกระทั่งน้ำที่ไหลออกจากรอยเปื้อนไม่มีสี เมื่อล้างอย่าให้น้ำไหลโดยตรงเพื่อล้างพื้นผิวที่เคลือบ การไหลของน้ำไม่ควรเร็วเกินไปหรือใหญ่เกินไปเพื่อไม่ให้ฟิล์มสเมียร์หลุดออก

5.6 การอบแห้ง เขย่าหยดน้ำบนสไลด์ออกให้แห้งตามธรรมชาติ เป่าแห้ง หรือใช้กระดาษดูดซับซับให้แห้งได้ (ระวังอย่าเช็ดตัวแบคทีเรียออก) 5.7 การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ สเมียร์ทำให้แห้งและตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ สเมียร์จะต้องแห้งสนิทก่อนจึงจะสามารถสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์น้ำมันได้

ผลลัพธ์ 6 รายการ วาดสัณฐานวิทยาของ E. coli และ Micrococcus garciniae หลังจากการย้อมครั้งเดียว

แกรมสเตน

1 วัตถุประสงค์
1.1 เพื่อทำความเข้าใจหลักการของคราบแกรมและความสำคัญในการจำแนกและจำแนกแบคทีเรีย

1.2 เพื่อเรียนรู้และเชี่ยวชาญเทคนิคการย้อมสีแกรม และรวบรวมการเรียนรู้การใช้เลนส์น้ำมันของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง