เทคนิคการย้อมสีและการสังเกตจุลชีพด้วยกล้องจุลทรรศน์
1. วัตถุประสงค์
1.1 เรียนรู้เทคนิคพื้นฐานของรอยเปื้อนและการย้อมสีจุลินทรีย์
1.2 ฝึกฝนวิธีการย้อมสีแบคทีเรียอย่างง่าย
1.3 ทำความเข้าใจเบื้องต้นเกี่ยวกับลักษณะทางสัณฐานวิทยาของแบคทีเรีย และรวบรวมความรู้การใช้เลนส์น้ำมันและเทคนิคการทำงานปลอดเชื้อ
2 หลักการ
การเปื้อนและการย้อมสีแบคทีเรียเป็นเทคนิคพื้นฐานในการทดลองทางจุลชีววิทยา เซลล์แบคทีเรียมีขนาดเล็กและโปร่งใส ทำให้ยากต่อการระบุด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงธรรมดา พวกเขาจะต้องเปื้อน ใช้สีย้อมเดี่ยวในการย้อมแบคทีเรีย เพื่อให้แบคทีเรียที่เปื้อนสีมีสีที่แตกต่างจากพื้นหลังอย่างชัดเจน จึงสามารถสังเกตสัณฐานวิทยาและโครงสร้างของพวกมันได้ชัดเจนยิ่งขึ้น วิธีนี้ใช้งานง่ายและเหมาะสำหรับการสังเกตรูปร่างทั่วไปของเซลล์แบคทีเรียและการจัดเรียงตัวของแบคทีเรีย สีย้อมพื้นฐานมักใช้สำหรับการย้อมสีแบบธรรมดา เนื่องจากในสารละลายที่เป็นกลาง เป็นด่าง หรือเป็นกรดอ่อน เซลล์แบคทีเรียมักจะมีประจุลบ และเมื่อสีย้อมพื้นฐานถูกไอออนไนซ์ ส่วนที่ย้อมสีของโมเลกุลจะมีประจุบวก จึงมีประจุเป็นด่าง ส่วนที่เปื้อนของสีย้อมจะรวมตัวกับแบคทีเรียเพื่อให้สีได้ง่าย เซลล์แบคทีเรียที่เปื้อนสีตัดกันอย่างชัดเจนกับพื้นหลัง ทำให้ง่ายต่อการระบุด้วยกล้องจุลทรรศน์ สีย้อมที่ใช้กันทั่วไปสำหรับการย้อมแบบธรรมดา ได้แก่ เมทิลีนบลู คริสตัลไวโอเล็ต ฟูกซินพื้นฐาน ฯลฯ เมื่อแบคทีเรียสลายน้ำตาลและผลิตกรด ส่งผลให้ค่า pH ของอาหารเลี้ยงเชื้อลดลง ประจุบวกของแบคทีเรียจะเพิ่มขึ้น ในขณะนี้ สามารถใช้สีย้อมที่เป็นกรด เช่น อีโอซิน กรดฟูซิน หรือแดงคองโกในการย้อมสีได้ ต้องซ่อมแซมแบคทีเรียก่อนการย้อมสี มีวัตถุประสงค์สองประการ: หนึ่งคือเพื่อฆ่าเชื้อแบคทีเรียและทำให้มันเกาะติดกับกระจกสไลด์ อีกประการหนึ่งคือเพื่อเพิ่มความสัมพันธ์กับสีย้อม วิธีการที่ใช้กันทั่วไปสองวิธีคือการให้ความร้อนและการตรึงสารเคมี เมื่อทำการซ่อมให้พยายามรักษารูปร่างของเซลล์เดิมไว้
3 วัสดุ
3.1 แบคทีเรีย: Bacillus subtilis 12-18h การเพาะเลี้ยงวุ้นด้วยสารอาหาร, Staphylococcus aureus การเพาะเลี้ยงวุ้นด้วยสารอาหาร 24 ชม., Escherichia coli 24 ชม. การเพาะเลี้ยงวุ้นด้วยสารอาหาร, การเพาะเลี้ยงวุ้นด้วยสารอาหารของยีสต์ขนมปัง
3.2 สารย้อมสี: สีย้อมอัลคาไลน์เมทิลีนบลูของ Lu (หรือสีย้อมสีม่วงแอมโมเนียมออกซาเลตคริสตัล), สีย้อมกรดคาร์โบลิกฟูชิน
3.3 เครื่องมือหรือเครื่องใช้อื่น ๆ ได้แก่ กล้องจุลทรรศน์ ตะเกียงแอลกอฮอล์ สไลด์ ห่วงใส่เชื้อ ชั้นวางสไลด์ ขวด 2 ชั้น (ประกอบด้วยน้ำมันซีดาร์และไซลีน) เนื้อเยื่อเลนส์ น้ำเกลือทางสรีรวิทยาหรือน้ำกลั่น เป็นต้น
4. กระบวนการ: ทา → การอบแห้ง → การตรึง → การย้อมสี → การซัก → การอบแห้ง → การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์
5 ขั้นตอน
5.1 สเมียร์: นำสไลด์แก้วที่สะอาดและปราศจากน้ำมันสองอัน ภายใต้สภาวะปลอดเชื้อ ให้หยดน้ำเกลือปกติ (หรือน้ำกลั่น) หยดเล็กๆ ลงบนกึ่งกลางของกระจกสไลด์ ใช้วงจรการฉีดวัคซีนเพื่อฆ่าเชื้อแบคทีเรียจาก Bacillus subtilis , Micrococcus luteus และ Escherichia coli หยิบสนามหญ้าที่มีแบคทีเรียเล็กน้อยในหยดน้ำบนทางลาด ผสมให้เข้ากัน แล้วทาเป็นแผ่นฟิล์มบางๆ หากคุณใช้สเมียร์สารแขวนลอยของแบคทีเรีย (หรือการเพาะเลี้ยงของเหลว) คุณสามารถใช้ห่วงสำหรับเพาะเชื้อเพื่อเลือก 2 ถึง 3 ลูปแล้วทาลงบนสไลด์โดยตรง ระวังอย่าให้น้ำเกลือทางสรีรวิทยา (น้ำกลั่น) หยดมากเกินไป และกำจัดแบคทีเรีย และทาให้ทั่วถึงและไม่หนาเกินไป
5.2 การอบแห้ง ตากให้แห้งตามธรรมชาติที่อุณหภูมิห้อง คุณยังสามารถอุ่นมันบนตะเกียงแอลกอฮอล์เล็กน้อยโดยหงายด้านที่เคลือบไว้เพื่อทำให้แห้ง แต่ต้องระวังอย่าเข้าใกล้เปลวไฟมากเกินไป เนื่องจากอุณหภูมิสูงเกินไปจะทำลายรูปร่างของแบคทีเรีย
5.3 การตรึง หากใช้การอบแห้งด้วยความร้อน การตรึงและการอบแห้งจะรวมกันเป็นขั้นตอนเดียว และวิธีการจะเหมือนกับการอบแห้ง ทาให้แห้งและติดด้วยความร้อน
5.4 การย้อมสี: วางสไลด์ให้ราบบนชั้นวางสไลด์ และเติมสารละลายสีย้อม 1 ถึง 2 หยดลงบนสเมียร์ (เหมาะสำหรับสารละลายสีย้อมที่จะคลุมฟิล์มสเมียร์เท่านั้น) ย้อมด้วยเมทิลีนบลูพื้นฐานของ Lu เป็นเวลา 1 ถึง 2 นาที และย้อมด้วยกรดคาร์โบลิกฟูกซิน (หรือสีม่วงคริสตัลแอมโมเนียมออกซาเลต) เป็นเวลาประมาณ 1 นาที
5.5 การล้างด้วยน้ำ: เทสารละลายสีย้อมออก และค่อยๆ ล้างด้วยน้ำประปาจากปลายด้านหนึ่งของสไลด์จนกระทั่งน้ำที่ไหลออกจากรอยเปื้อนไม่มีสี เมื่อล้างด้วยน้ำ ห้ามล้างพื้นผิวที่เคลือบด้วยน้ำโดยตรง การไหลของน้ำไม่ควรเร็วหรือใหญ่เกินไปเพื่อป้องกันไม่ให้ฟิล์มสเมียร์หลุดออก
5.6 การอบแห้ง: สะบัดหยดน้ำบนสไลด์ออกแล้วเช็ดให้แห้งตามธรรมชาติ เป่าให้แห้งด้วยเครื่องเป่าผมหรือดูดซับด้วยกระดาษดูดซับ (ระวังอย่าเช็ดแบคทีเรียออก) 5.7 การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ หลังจากสเมียร์แห้งแล้ว ให้ทำการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ สเมียร์ต้องแห้งสนิทก่อนดูด้วยเลนส์น้ำมัน
ผลลัพธ์ 6 รายการ วาดลักษณะทางสัณฐานวิทยาของ E. coli และ Micrococcus luteus ที่สังเกตได้หลังจากการย้อมครั้งเดียว
