กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบสองโฟตอนมีข้อดีหลายประการ:
1) ความยาวคลื่นที่ยาวกว่าของแสงจะได้รับผลกระทบจากการกระเจิงน้อยกว่าความยาวคลื่นที่สั้นกว่าของแสงที่จะทะลุผ่านชิ้นงานทดสอบ
(2) โมเลกุลของฟลูออเรสเซนต์ที่อยู่นอกระนาบโฟกัสจะไม่ถูกกระตุ้นเพื่อให้แสงกระตุ้นสามารถเข้าถึงระนาบโฟกัสได้มากขึ้น เพื่อให้แสงกระตุ้นสามารถเจาะลึกเข้าไปในชิ้นงานได้ลึกยิ่งขึ้น
3) ความยาวคลื่นที่ยาวกว่าของแสงอินฟราเรดใกล้จะเป็นพิษต่อเซลล์น้อยกว่าความยาวคลื่นที่สั้นกว่า
4) เมื่อใช้กล้องจุลทรรศน์สองโฟตอนเพื่อสังเกตชิ้นงาน จะเกิดการฟอกสีด้วยแสงและความเป็นพิษต่อแสงที่ระนาบโฟกัสเท่านั้น ดังนั้น กล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอนจึงเหมาะสมกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบโฟตอนเดี่ยวสำหรับการสังเกตตัวอย่างที่มีความหนา สำหรับการสังเกตเซลล์ที่มีชีวิต หรือสำหรับการทดลองการฟอกสีด้วยแสงเฉพาะจุด
ความรู้เรื่องกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงคอนโฟคอล
หลักการพื้นฐานของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลฟลูออเรสเซนซ์: แหล่งกำเนิดแสงแบบจุดจะใช้ในการฉายรังสีชิ้นงาน ทำให้เกิดจุดแสงขนาดเล็กที่มีความชัดเจนชัดเจนบนระนาบโฟกัส แสงเรืองแสงที่ปล่อยออกมาจากจุดนี้หลังจากการฉายรังสีจะถูกรวบรวมโดยเลนส์ใกล้วัตถุ และส่งกลับไปยังตัวแยกลำแสงซึ่งประกอบด้วยกระจกสีสองทิศทางตามเส้นทางแสงการฉายรังสีดั้งเดิม ตัวแยกลำแสงจะส่งแสงฟลูออเรสเซนต์ไปยังเครื่องตรวจจับโดยตรง ทั้งแหล่งกำเนิดแสงและตัวตรวจจับต่างก็มีรูเข็มอยู่ด้านหน้า เรียกว่ารูเข็มส่องสว่างและรูเข็มตรวจจับ ตามลำดับ ทั้งสองมีรูปทรงเรขาคณิตที่เหมือนกัน ประมาณ 100-200 นาโนเมตร และมีการคอนจูเกตสัมพันธ์กับจุดแสงบนระนาบโฟกัส กล่าวคือ จุดของแสงที่ผ่านชุดเลนส์ต่างๆ และท้ายที่สุดก็สามารถเพ่งความสนใจไปที่ทั้งการส่องสว่างได้ และรูเข็มของเครื่องตรวจจับ ด้วยวิธีนี้ แสงจากระนาบโฟกัสสามารถมาบรรจบกันภายในรูรับแสงของโพรบ ในขณะที่แสงที่กระเจิงจากด้านบนหรือด้านล่างของระนาบโฟกัสจะถูกบังไว้ด้านนอกรูรับแสงของโพรบ และไม่สามารถถ่ายภาพได้ เลเซอร์จะสแกนตัวอย่างทีละจุด และหลอดโฟโตมัลติพลายเออร์หลังจากตรวจพบรูเข็มยังได้รับภาพคอนโฟคอลของจุดแสงที่สอดคล้องกันทีละจุด ซึ่งจะถูกแปลงเป็นสัญญาณดิจิทัลและส่งไปยังคอมพิวเตอร์ และในที่สุดก็มาบรรจบกันเป็นที่ชัดเจน ภาพคอนโฟคอลของระนาบโฟกัสทั้งหมดบนหน้าจอ
ภาพระนาบโฟกัสแต่ละภาพจริงๆ แล้วเป็นภาพตัดขวางเชิงแสงของชิ้นงานทดสอบ และภาพตัดขวางเชิงแสงนี้จะมีความหนาที่แน่นอนเสมอ หรือที่เรียกว่าแผ่นแสง เนื่องจากความเข้มของแสงที่จุดโฟกัสมากกว่าความเข้มของจุดที่ไม่ใช่โฟกัสมาก และแสงระนาบที่ไม่ใช่โฟกัสจะถูกกรองออกโดยรูเข็ม ระยะชัดลึกของระบบคอนโฟคอลจึงประมาณเป็นศูนย์ และการสแกน ตามแนวแกน Z ช่วยให้การตรวจเอกซเรย์ด้วยแสงสร้างชิ้นแสงสองมิติของชิ้นงานทดสอบที่จะสังเกตที่จุดโฟกัส เมื่อรวมการสแกนระนาบ XY (ระนาบโฟกัส) เข้ากับการสแกนในแกน Z (แกนออปติคอล) จะทำให้ได้ภาพสามมิติของตัวอย่างโดยการสะสมเลเยอร์ที่ต่อเนื่องกันของภาพสองมิติ ซึ่งประมวลผลโดยซอฟต์แวร์คอมพิวเตอร์เฉพาะทาง
ซึ่งหมายความว่ารูเข็มการตรวจจับและรูเข็มของแหล่งกำเนิดแสงจะถูกโฟกัสที่จุดเดียวกันเสมอ ดังนั้นการเรืองแสงที่ตื่นเต้นนอกระนาบโฟกัสจึงไม่สามารถเข้าไปในรูเข็มการตรวจจับได้
หลักการทำงานของคอนโฟคอลเลเซอร์แสดงไว้อย่างง่ายๆ ว่าใช้เลเซอร์เป็นแหล่งกำเนิดแสง โดยอาศัยการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบดั้งเดิม อุปกรณ์สแกนเลเซอร์เพิ่มเติม และอุปกรณ์โฟกัสคอนจูเกต ผ่านการควบคุมด้วยคอมพิวเตอร์เพื่อดำเนินการระบบรับและประมวลผลภาพดิจิทัล
