วัตถุประสงค์ของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลคืออะไร?
1. หลังจากความพยายามและการปรับปรุงกล้องรุ่นก่อนๆ ของเรา กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงได้มาถึงจุดที่สมบูรณ์แบบแล้ว อันที่จริง กล้องจุลทรรศน์ธรรมดาสามารถให้ภาพที่สวยงามด้วยกล้องจุลทรรศน์แก่เราได้อย่างง่ายดายและรวดเร็ว อย่างไรก็ตาม เหตุการณ์ที่นำนวัตกรรมที่ปฏิวัติวงการมาสู่โลกของกล้องจุลทรรศน์ที่เกือบจะสมบูรณ์แบบนี้เกิดขึ้น ซึ่งก็คือการประดิษฐ์ "กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลสแกนด้วยเลเซอร์" คุณสมบัติของกล้องจุลทรรศน์ชนิดใหม่นี้คือใช้ระบบออปติคัลที่จะแยกเฉพาะข้อมูลภาพบนพื้นผิวที่โฟกัสอยู่ และกู้คืนข้อมูลที่ได้รับในหน่วยความจำภาพในขณะที่เปลี่ยนโฟกัส เพื่อให้ได้ข้อมูล 3D ที่สมบูรณ์ ได้รับ ภาพลักษณ์ของความเฉลียวฉลาด ด้วยวิธีนี้ ทำให้สามารถรับข้อมูลเกี่ยวกับรูปร่างพื้นผิวที่ไม่สามารถยืนยันด้วยกล้องจุลทรรศน์ธรรมดาได้อย่างง่ายดาย นอกจากนี้ สำหรับกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงธรรมดา "การเพิ่มความละเอียด" และ "ความลึกของโฟกัสที่ลึกขึ้น" เป็นเงื่อนไขที่ขัดแย้งกัน โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อใช้กำลังขยายสูง ความขัดแย้งนี้เด่นชัดกว่า แต่ในแง่ของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล ปัญหานี้แก้ไขได้ง่าย
2. ข้อดีของระบบคอนโฟคอลออปติก
แผนผังของกล้องจุลทรรศน์เลเซอร์คอนโฟคอล
ระบบออปติกแบบคอนโฟคอลทำการให้แสงแบบจุดบนตัวอย่าง และตัวรับแบบจุดจะรับแสงสะท้อนด้วย เมื่อวางตัวอย่างไว้ในตำแหน่งโฟกัส แสงสะท้อนเกือบทั้งหมดจะไปถึงเซลล์รับแสง และเมื่อตัวอย่างอยู่นอกโฟกัส แสงสะท้อนจะไม่ไปถึงเซลล์รับแสง กล่าวคือ ในระบบคอนโฟคอลออปติคัล เฉพาะภาพที่ตรงกับจุดโฟกัสเท่านั้นที่จะถูกส่งออก และจุดแสงและแสงกระจัดกระจายที่ไร้ประโยชน์จะถูกป้องกัน
3. ทำไมต้องใช้เลเซอร์?
ในระบบออปติกคอนโฟคอล ตัวอย่างจะส่องสว่างที่จุดหนึ่ง และแสงสะท้อนยังได้รับจากจุดรับแสงด้วย ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีแหล่งกำเนิดแสงแบบจุด เลเซอร์เป็นแหล่งกำเนิดแสงที่ตรงจุดมาก ในกรณีส่วนใหญ่ แหล่งกำเนิดแสงเลเซอร์ถูกใช้เป็นแหล่งกำเนิดแสงสำหรับกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล นอกจากนี้ ลักษณะของความเป็นสีเดียว ทิศทาง และรูปร่างของลำแสงที่ยอดเยี่ยมของเลเซอร์ยังเป็นเหตุผลสำคัญสำหรับการยอมรับในวงกว้าง
4. การสังเกตตามเวลาจริงโดยใช้การสแกนความเร็วสูงเป็นไปได้
สำหรับการสแกนด้วยเลเซอร์ ยูนิตเบี่ยงเบนออปติคอลที่เปิดใช้งานเสียง (Acoustic Optical Deflector, องค์ประกอบ AO) ใช้ในแนวนอน และกระจก Servo Galvano ใช้ในแนวตั้ง เนื่องจากยูนิตเบี่ยงเบนอะคูสติกออปติคอลไม่มีส่วนสั่นสะเทือนเชิงกล จึงสามารถทำการสแกนด้วยความเร็วสูงและการสังเกตแบบเรียลไทม์บนหน้าจอมอนิเตอร์ได้ การถ่ายภาพความเร็วสูงนี้เป็นสิ่งสำคัญมากที่ส่งผลโดยตรงต่อความเร็วในการโฟกัสและการดึงตำแหน่ง
5. ความสัมพันธ์ระหว่างตำแหน่งโฟกัสและความสว่าง
ในระบบคอนโฟคอลออปติก ความสว่างของตัวอย่างจะสูงสุดเมื่อวางตัวอย่างในตำแหน่งโฟกัสอย่างถูกต้อง และความสว่างจะลดลงอย่างรวดเร็วทั้งก่อนและหลัง (เส้นทึบในรูปที่ 4) การเลือกที่ละเอียดอ่อนของระนาบโฟกัสยังเป็นหลักการของการกำหนดทิศทางความสูงของกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลและการขยายความลึกของโฟกัส ในทางตรงกันข้าม กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงธรรมดาไม่มีการเปลี่ยนแปลงความสว่างอย่างมีนัยสำคัญทั้งก่อนและหลังตำแหน่งโฟกัส
6. ความคมชัดสูง ความละเอียดสูง
ในกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงทั่วไป เนื่องจากการรบกวนของแสงสะท้อนจากส่วนโฟกัส แสงจะทับซ้อนกับส่วนสร้างภาพโฟกัส ส่งผลให้คอนทราสต์ของภาพลดลง ในทางกลับกัน ในระบบคอนโฟคอลออปติก แสงที่กระจัดกระจายภายนอกจุดโฟกัสและแสงที่กระจัดกระจายภายในเลนส์ใกล้วัตถุจะถูกลบออกเกือบหมด เพื่อให้ได้ภาพที่มีความเปรียบต่างสูงมาก นอกจากนี้ เนื่องจากแสงผ่านเลนส์ใกล้วัตถุสองครั้ง ภาพจุดจึงมีความคมชัดก่อน ซึ่งจะช่วยปรับปรุงกำลังการแยกภาพของกล้องจุลทรรศน์ด้วย
7. ฟังก์ชั่นการแปลด้วยแสง
ในระบบคอนโฟคอลออปติก แสงสะท้อนนอกเหนือจากจุดที่ตกกระทบกับจุดโฟกัสจะถูกป้องกันโดยไมโครพอร์ ดังนั้น เมื่อสังเกตตัวอย่างสามมิติ ภาพจะถูกสร้างขึ้นราวกับว่าตัวอย่างถูกแบ่งส่วนด้วยระนาบโฟกัส (รูปที่ 5) เอฟเฟ็กต์นี้เรียกว่าการแปลด้วยแสงและเป็นหนึ่งในความพิเศษของระบบออปติคัลคอนโฟคอล
8. โฟกัสฟังก์ชั่นหน่วยความจำมือถือ
สิ่งที่เรียกว่าแสงสะท้อนที่อยู่นอกจุดโฟกัสนั้นถูกป้องกันโดยไมโครพอร์ ในทางกลับกัน ถือได้ว่าจุดทั้งหมดบนภาพที่เกิดจากระบบออปติกคอนโฟคอลนั้นตรงกับจุดโฟกัส ดังนั้น หากย้ายตัวอย่างสามมิติไปตามแกน Z (แกนออปติคัล) ภาพจะถูกสะสมและจัดเก็บไว้ในหน่วยความจำ และสุดท้ายจะได้ภาพที่เกิดจากตัวอย่างทั้งหมดและจุดโฟกัส ฟังก์ชันของความลึกของโฟกัสที่ลึกลงไปอย่างไม่มีที่สิ้นสุดในลักษณะนี้เรียกว่าฟังก์ชันของหน่วยความจำมือถือ
9. ฟังก์ชั่นการวัดรูปร่างพื้นผิว
ในแง่ของฟังก์ชันการเปลี่ยนโฟกัส รูปร่างพื้นผิวของตัวอย่างสามารถวัดได้แบบไม่สัมผัสโดยการเพิ่มวงจรบันทึกความสูงของพื้นผิว จากฟังก์ชันนี้ ทำให้สามารถบันทึกพิกัดแกน Z ที่เกิดจากค่าความสว่างสูงสุดในแต่ละพิกเซลได้ และจากข้อมูลนี้ จะสามารถรับข้อมูลที่เกี่ยวข้องกับรูปร่างของพื้นผิวตัวอย่างได้
10. ฟังก์ชั่นการวัดขนาดไมโครที่มีความแม่นยำสูง
หน่วยรับแสงใช้ 1-เซ็นเซอร์ภาพ CCD แบบระบุมิติ ดังนั้นจึงไม่ได้รับผลกระทบจากการเอียงในการสแกนของอุปกรณ์สแกน จึงสามารถวัดค่าที่มีความแม่นยำสูงได้ นอกจากนี้ เนื่องจากการใช้ฟังก์ชันหน่วยความจำการเลื่อนโฟกัสพร้อมความลึกของโฟกัสที่ปรับได้ (ความลึก) จึงสามารถขจัดข้อผิดพลาดในการวัดที่เกิดจากการเลื่อนโฟกัสได้
11. การวิเคราะห์ภาพสามมิติ
เมื่อใช้ฟังก์ชันการวัดรูปร่างพื้นผิว คุณสามารถสร้างภาพสามมิติของพื้นผิวตัวอย่างได้อย่างง่ายดาย ไม่เพียงเท่านั้น แต่ยังสามารถทำการวิเคราะห์ได้หลากหลาย เช่น: การวัดความหยาบของพื้นผิว, พื้นที่, ปริมาตร, พื้นที่ผิว, ความกลม, รัศมี, ความยาวสูงสุด, เส้นรอบวง, จุดศูนย์ถ่วง, ภาพโทโมกราฟี, การแปลง FFT, การวัดความกว้างของเส้น เป็นต้น .
กล้องจุลทรรศน์สแกนคอนโฟคอลแบบเลเซอร์ไม่เพียงแต่ใช้สำหรับการสังเกตสัณฐานวิทยาของเซลล์เท่านั้น แต่ยังใช้สำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณของส่วนประกอบทางชีวเคมีภายในเซลล์ สถิติความหนาแน่นของแสง และการวัดสัณฐานวิทยาของเซลล์ด้วย
